doi: 10.15389/agrobiology.2022.4.762rus
УДК 579.6:577.2
Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 19-316-90041 «Полногеномное секвенирование штаммов бацилл, выделенных из рубцового содержимого различных жвачных животных».
БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ШТАММА Bacillus velezensis КР-2 С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ СВОЙСТВ
Г.Ю. ЛАПТЕВ1 ✉, Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ1, Т.П. ДУНЯШЕВ1,
Л.А. ИЛЬИНА1, Д.Г. ТЮРИНА2, В.А. ФИЛИППОВА1,
Е.А. БРАЖНИК2, Н.В. ТАРЛАВИН2, Е.С. ПОНОМАРЕВА2,
А.В. ДУБРОВИН2, К.А. КАЛИТКИНА1, Н.И. НОВИКОВА2,
А.В. ПЛАТОНОВ3
Представители рода Bacillus активно используются при создании биопрепаратов для сельского хозяйства в связи со способностью продуцировать широкий спектр биологически активных молекул, обладающих антимикробной активностью, стимулирующих рост растений и восстанавливающих баланс микроорганизмов в пищеварительной системе животных. В представленной работе у штамма Bacillus velezensis КР-2 впервые был выявлен уникальный путь внутриклеточного синтеза осмопротектора глицин-бетаина при участии генов BetA, BetВ, BetT, BetC, о котором у бактерий рода Bacillus ранее не сообщалось. Обнаруженная нами особенность генома B. velezensis КР-2, связанная с синтезом сидерофора миксохелина A, вероятно, также уникальна для этого штамма в отличие от других изученных штаммов, относящихся к виду B. velezensis, поскольку не описана в литературе. Целью исследования был молекулярно-биологический анализ и биоинформатическая аннотация генома штамма Bacillus velezensis КР-2для выявления генетических детерминант, определяющих возможность биосинтеза разнообразных биологически активных веществ, важных для создания биопрепаратов для сельского хозяйства. Материалом служил штамм B. velezensis КР-2 из коллекции ООО «БИОТРОФ+», выделенный из рубца молочной коровы. Антимикробную активность штамма бактерии исследовали методом отсроченного антагонизма. ДНК выделяли по стандартным методикам с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Библиотеку ДНК для полногеномного секвенирования готовили с помощью набора Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Нуклеотидные последовательности определяли с использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США). Отфильтрованные по длине не менее чем от 50 до 150 п.н. парноконцевые последовательности собирали de novo с использованием геномного сборщика SPAdes-3.11.1 с соответствующими ключами. Сравнительный анализ генома штамма B. ve-lezensis КР-2 с нуклеотидными последовательностями других микроорганизмов проводили при использовании баз данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для филогенетического анализа последовательность гена 16S рРНК передавали на веб-сервис Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для перевода нуклеотидной последовательности контигов в аминокислотную использовали PROKKA 1.12 (https://bioweb.pasteur.fr/packages/pack@prokka@1.12). Функциональную аннотацию генома проводили с помощью веб-сервиса RAST 2.0 (https://rast.nmpdr.org). Для оценки пула генов, связанных с биотехнологически ценными свойствами, и построения метаболических карт использовали базу данных KEGG Pathway (http://www.genome.jp/kegg/). В результате полногеномного секвенирования получили 16 контигов с общей длиной 3936398 п.н., содержащих 46,6 % ГЦ-пар, с качеством N50 2109194 п.н. и N75 844068 п.н. В состав хромосомы входили 3854 кодирующие последовательности (CDS), связанные с синтезом полипептидов. Были выявлены 464 метаболические подсистемы, наиболее представленными из которых оказались подсистемы метаболизма аминокислот и их производных (431) и метаболизма углеводов (416). У штамма B. velezensis КР-2 обнаружен комплекс потенциальных свойств, включая синтез антимикробных пептидов, жирных кислот, витаминов, сидерофоров, ауксинов, способность к адгезии, устойчивость к токсическим соединениям, моторику и хемотаксис, возможность противостоять стрессовым факторам, стимулировать рост растений и участвовать в метаболизме фосфатов. В частности, в геноме B. velezensis КР-2 показано присутствие генов (BacA, BacB, BacG, BacF, BacD), вовлеченных в образование бацилизина — нерибосомно синтезируемого антимикробного бактериоцина. Данные о возможности синтеза этого дипептида согласуются с фенотипической характеристикой штамма — наблюдаемым in vitro антагонизмом в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Fusarium oxysporum и Clostridium butyricum. У B. velezensis КР-2 нами выявлен уникальный путь внутриклеточного синтеза осмопротектора глицин-бетаина при участии генов BetA, BetВ, BetT, BetC, о наличии которого у бактерий рода Bacillus ранее не сообщалось. Выявлена способность синтезировать ауксины — индол-3-этанола, с продукцией которого ассоциированы гены IAR, TO, индол-3-ацетальдегида (IAD, AAD, AO) и индол-3-ацетонитрила (N3). В геноме B. velezensis КР-2 мы также идентифицировали несколько кластеров генов, ассоциированных с синтезом сидерофоров (DhbA, DhbB, DhbC, FeuA, FeuB, FeuC, FeuD). Судя по данным лабораторных исследований и полногеномного секвенирования, штамм бактерии B. velezensis КР-2 — это один из бактериальных ресурсов, полезных для использования в сельском хозяйстве. Обнаруженные нами уникальные пути синтеза глицин-бетаина при участии генов BetA, BetВ, BetT, BetC важны для клеточной адаптации штамма B. velezensis КР-2 к высокоосмолярному стрессу, который создается в средах, подверженных частым колебаниям содержания воды, например в подвяленной растительной массе силоса и верхних слоях почвы.
Ключевые слова: полногеномное секвенирование, Bacillus velezensis, биологически активные вещества, антимикробная активность, бацилизин, глицин-бетаин, пробиотики, PGPR, стартерные культуры.
G.Y. Laptev1✉, E.A. Yildirim1, T.P. Dunyashev1, L.A. Ilyina1,
D.G. Tyurina2, V.A. Filippova1, E.A. Brazhnik2, N.V. Tarlavin2,
E.S. Ponomareva2, A.V. Dubrovin2, K.A. Kalitkina1, N.I. Novikova2,
A.V. Platonov3
Members of the genus Bacillus are actively used to create biological preparations for agriculture due to their ability to produce a wide range of biologically active molecules with antimicrobial activity, stimulating plant growth and restoring the balance of microorganisms in the digestive system of animals. This paper presents for the first time research data on the identification of a unique pathway for intracellular synthesis of the osmoprotectant glycine betaine encoded by the BetA, BetB, BetT, and BetC genes, which has not previously been found in the genus Bacillus. The peculiarity of the B. velezensis KR-2 genome associated with the synthesis of the siderophore myxochelin A, which we have identified, is probably also unique among other strains of B. velezensis, since it has not been previously described. The aim of the study was whole genome sequencing (WGS) and bioinformatic annotation of the Bacillus velezensis KR-2 genome to identify genetic determinants capable of encoding biosynthesis of various bioactive substances for agriculture. The B. velezensis KR-2 strain isolated from the rumen of a dairy cow (the collection of OOO BIOTROF+) was examined. Its antimicrobial activity was investigated using the differed antagonism assay. DNA was isolated according to standard procedures with the Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). A DNA library for WGS was prepared using the Nextera XT kit (Illumina, Inc., USA). Nucleotide sequences were determined using a MiSeq instrument (Illumina, Inc., USA). Paired-end reads filtered by length not less than 50 to 150 bp were assembled de novo using the SPAdes-3.11.1 genomic assembler with appropriate keys. Comparative analysis of the B. velezensis KR-2 genome with other microorganisms was performed using the NCBI databases (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). For phylogenetic analysis, the 16S rRNA gene sequence was transferred to the Nucleotide BLAST web service (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). PROKKA 1.12 (https://bioweb.pasteur.fr/packages/pack@prokka@1.12) was used to convert contig sequences into an amino acid sequences. Functional annotation of the genome was performed using the RAST 2.0 web service (https://rast.nmpdr.org). The KEGG Pathway database (http://www.genome.jp/kegg/) was used to evaluate the pool of genes associated with biotechnologically valuable properties and build metabolic maps. WGS resulted in 16 contigs with a total length of 3936398 bp, containing 46.6 % of GC; the N50 and N75 conting size was 2109194 and N75 844068 bp, respectively. The chromosome contained 3854 coding sequences (CDS) associated with the synthesis of polypeptides. Among the 464 identified metabolic subsystems, the subsystems of amino acids and their derivatives and carbohydrates were the most numerous, 431 and 416, respectively. The B. velezensis KR-2 strain has a whole range of potential properties, including the production of antimicrobial peptides, fatty acids, vitamins, siderophores, auxins, the ability to adhere, to resist toxic compounds and stress factors, to stimulate plant growth and phosphate metabolism, the motility and chemotaxis. In particular, the B. velezensis КR-2 genome contains genes (BacA, BacB, BacG, BacF, BacD) involved in the production of the dipeptide bacilysine, a non-ribosomal bacteriocin. This is consistent with the phenomenon of antagonism against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Fusarium oxysporum, and Clostridium butyricum. In the B. velezensis КR-2 genome, we have found a unique pathway for intracellular synthesis of the osmoprotectant glycine betaine (the BetA, BetB, BetT, BetC genes) not previously detected in the genus Bacillus. B. velezensis КR-2 is a putative producer of auxins, such as indole-3 ethanol (IAR, TO), indole-3-acetaldehyde (IAD, AAD, AO) and indole-3-acetonitrile (N3). Several gene clusters associated with siderophore synthesis (DhbA, DhbB, DhbC, FeuA, FeuB, FeuC, FeuD) were also identified in the genome of B. velezensis KP-2. Our findings indicate that B. velezensis KR-2 is a bacterial resource for agriculture. The unique biosynthesis pathway for glycine betaine (BetA, BetB, BetT, and BetC) that we have discovered are important for the B. velezensis KP-2 adaptation to high-osmolar stress under fluctuations in water content, for example, in dried silage and upper layers of soil.
Keywords: whole genome sequencing, Bacillus velezensis, bioactive substances, antimicrobial activity, bacilysine, glycine betaine, probiotics, PGPR, starter cultures.
1ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный |
Поступила в редакцию |
