doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1148rus
УДК 636.5:591.16:611.013.11:57.04
Работа проведена в рамках выполнения научных исследований Министерства науки и высшего образования РФ по теме № АААА-А18-118021590132-9.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОМБИНАЦИЙ САХАРИДОВ В СРЕДАХ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ ПЕТУХОВ
Ю.Л. СИЛЮКОВА ✉, О.И. СТАНИШЕВСКАЯ, Н.В. ПЛЕШАНОВ,
А.А. КУРОЧКИН
Различные комбинации сахаридов могут обеспечить эффективную защиту семени во время цикла замораживания/оттаивания. До настоящего времени дисахарид мальтоза не использовался в качестве компонента среды для криоконсервации семени петухов. Поскольку мальтоза не участвует в углеводном обмене сперматозоидов, есть предположение о ее роли в укреплении структуры гликокаликса. В представленной работе впервые доказана эффективность использования мальтозы в сочетании с фруктозой в составе разбавителя для повышения оплодотворяющей способности заморожено-оттаянного семени петухов. Целью работы было определение оптимальной концентрации мальтозы в составе разбавителя для замораживания семени петухов в возрасте 44-50 нед и установление сроков сохранения функциональной полноценности заморожено-оттаянного семени в половых путях курицы. Эксперимент проводился в ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ) на курах (Gallus gallus L.) породы русская белая (♂n = 10, ♀n = 30) в возрасте 44-50 нед. Сперму получали методом абдоминального массажа. Оценивали три варианта сред для криоконсервации семени с различным соотношением сахаридов: Mal-10 (фруктоза 0,72 %, мальтоза 0,166 %), Mal-20 (фруктоза 0,64 %, мальтоза 0,326 %) и ЛКС-контроль (Ленинградская криозащитная среда) (фруктоза 0,8 %, мальтоза 0 %). Разбавленные образцы семени охлаждали с 18 до 5 °C в течение 40 мин. Затем к каждому образцу добавляли диметилацетамид до конечной концентрации 6 %. Образцы инкубировали при 5 °C в течение 1 мин. Гранулы замораживали, накапывая семя в жидкий азот. Замороженное семя хранили в жидком азоте в течение 30 сут. Гранулы размораживали по fast-протоколу при 60 °С. Двигательную активность заморожено-оттаянных сперматозоидов оценивали в каждом экстендере с помощью визуализирующей системы CASA (сomputer-assisted sperm analysis). Для искусственного осеменения отобрали виргинных кур в возрасте 46-50 нед (n = 30, по n = 10 в каждой опытной группе). Кур осеменяли интравагинально разовыми суточными дозами 0,04-0,07 мл заморожено-оттаянного семени: в течение первых 2 сут по одному осеменению, затем одно осеменение каждые 2 сут. Яйца для инкубации собирали ежедневно в течение 9 сут, начиная со следующего дня после первого осеменения. Яйца (n = 239) инкубировали 6 сут для оценки фертильности. Яйца, собранные в каждой экспериментальной группе на 5-е, 10-е и 15-е сут после последнего осеменения, разбивали и оценивали оплодотворенность по наличию бластодиска. Динамику функционального состояния заморожено-оттаянных сперматозоидов в половых путях кур определяли на 5-е, 10-е и 15-е сут от последнего осеменения. В вителлиновой мембране подсчитывали отверстия — точки взаимодействия со сперматозоидами. Было обнаружено повышение общей доли оплодотворенных яиц при использовании заморожено-оттаянного семени в группах Mal-10 (92,6 %) и Mal-20 (86,3 %) по сравнению с группой ЛКС-контроль (74,7 %), а также увеличение продолжительности функциональной полноценности сперматозоидов в половых путях кур в течение 5 сут. По прогрессивной подвижности сперматозоидов (целостности кинетического аппарата) группы не различались, при этом функциональная полноценность, оцененная по числу взаимодействий с вителлиновой мембраной, существенно разнилась. Она была значительно выше при использовании экспериментальных сред Mal-10 (67,0 шт/см2) и Mal-20 (110,7 шт/см2) по сравнению с контролем (40,1 шт/см2). Наилучшие показатели фертильности сперматозоидов отмечали в группе Mal-20: даже на 15-е сут после последнего осеменения оплодотворяющая способность заморожено-оттаянного семени составляла 20 %. Согласно составленному уравнению регрессии, для приемлемой оплодотворенности яиц (не менее 80 %) достаточна такая функциональная полноценность заморожено-оттаянных сперматозоидов, при которой число точек взаимодействия с вителлиновой мембраной желтка составляет не менее 60 шт/см2. Это было достигнуто при использовании экспериментального разбавителя с 0,326 г мальтозы на 100 мл. Полученные результаты открывают перспективы использования криоконсервированного семени птицы как для сохранения генофонда, так и в селекционных программах.
Ключевые слова: петухи, сперма, фертильность, криоконсервация, разбавитель, мальтоза, вителлиновая мембрана.
Yu.I. Silyukova ✉, O.I. Stanishevskaya, N.V. Pleshanov,
A.A. Kurochkin
Different combination of saccharides can provide better semen protection during freezing/thawing cycle. Until now, the disaccharide maltose has not been used as a component of the medium for cryopreservation roosters’ semen. Since maltose is not involved in carbohydrate metabolism of spermatozoa, there is an assumption about its role in strengthening the structure of the glycocalyx, which is a progressive evolutionary cellular structure that regulates specific cellular adaptations to a certain temperature, chemical and other paratypical effects. In this work, in order to increase the fertility of frozen/thawed semen, we tested a combination of saccharides in the diluent for cryopreservation of roosters’ semen. For the first time, maltose has been proven to be effective in combination with fructose in a diluent to increase the fertility of frozen/thawed roosters’ semen. The aim of the study was to determine the optimal concentration of the test component of maltose based on the diluent of the Leningrad Cryoprotective Medium (LCM) (1984) for freezing the semen of roosters and determining the time of maintaining the functional usefulness of frozen/thawed cock semen in the genital tract of the hen. The experiment was carried out in the Center for Collective Use Genetic collection of rare and endangered chicken breeds (the Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, 2020) on a breed of Russian white chickens (♂n = 10, ♀n = 30) at the age of 46-50 weeks. Three variants of media for cryopreservation of roosters’ semen with different ratios of saccharides were evaluated. In each group, the Mal-10 (fructose 0.72 %, maltose 0.166 %), Mal-20 (fructose 0.64 %, maltose 0.326 %) and LCS-control (fructose 0.8 %, maltose 0 %), there were 10 hens for insemination. The results show not only an increase in the total percentage of fertilized eggs when using frozen/thawed semen in the Mal-10 (92.6 %) and Mal-20 (86.3 %) groups compared to the LKS-control group (74.7 %), but also an increase in the duration of the functional usefulness of spermatozoa in the genital tract of hen within 5 days at the level of native sperm. Counting the points of interaction of spermatozoa with the perivitelline membrane of the yolk 5 days after the last insemination showed that the functional ability of spermatozoa is much higher when using experimental media containing maltose, 67.0 pcs/cm2 for Mal-10 and 110.7 pcs/cm2 for Mal-20 vs. 40.1 pcs/cm2 in maltose-free LKS-control. The longest duration of the functional usefulness of spermatozoa was noted in the Mal-20 group. Even on day 15 after the last insemination, the fertilization capacity of frozen/thawed semen was recorded at the level of 20 %. A regression equation was drawn up for the relationship of egg fertilization with the points of interaction of spermatozoa with the perivitelline membrane of the yolk. To obtain an egg fertilization level of ≥ 80 %, the functional usefulness of frozen-thawed spermatozoa (expressed through the number of points of interaction with the perivitelline membrane of the yolk) should be ≥ 60 pcs/cm2. This was achieved by using an experimental diluent with 0.326 % maltose. The results obtained open up the possibility of using cryopreserved semen not only in preserving the gene pool, but also in breeding programs.
Keywords: roosters, semen, fertility, cryopreservation, media, maltose, perivitelline membrane.
Всероссийский НИИ генетики и разведения |
Поступила в редакцию |
