doi: 10.15389/agrobiology.2020.4.784rus
УДК 636.2:591.465.12:576:576.3/.7.086.83:591.04
Работа выполнена в соответствии с темой проекта № 18-016-00147А, финансируемого Российским Фондом Фундаментальных исследований (РФФИ).
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ И СТАТУС
ХРОМАТИНА НАТИВНЫХ И ДЕВИТРИФИЦИРОВАННЫХ
ООЦИТОВ Bos taurus ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ НАНОЧАСТИЦ
ВЫСКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМА
Т.И. КУЗЬМИНА1, И.В. ЧИСТЯКОВА1, Д.Н. ТАТАРСКАЯ2
Митохондрии — единственные клеточные компартменты, генерирующие и трансформирующие энергию в клетке. На изменение экстра- и внутриклеточных условий (ионный гомеостаз, степень дегидратации, температура) эти органеллы реагируют одними из первых. При обработке сверхнизкими температурами вследствие перекисного окисления липидов нарушается работа АТФ-синтетазного комплекса (Е.А. Новодержкина с соавт., 2016), а также структура генетического материала. В качестве цитопротекторных соединений могут быть предложены наночастицы высокодисперсного кремнезема (нВДК). Аморфная форма диоксида кремния, или высокодисперсный кремнезем, проявляющий свою биологическую активность через высокую адсорбирующую способность, снижает концентрацию ионов и биополимеров во время дегидратации клетки при криоконсервации (Т.Т. Туров с соавт., 2011). В настоящей работе впервые показано, что при использовании наночастиц высокодисперсного кремнезема в концентрации 0,001 % в технологии витрификации и экстракорпорального созревания девитрифицированных ооцитов (ДВ) коров наблюдается повышение митохондриального потенциала ДВ ооцитов и снижение числа дегенерированных клеток. Цель исследования — идентифицировать характер воздействия наночастиц высокодисперсного кремнезема на функциональную активность митохондрий и статус хроматина в нативных и девитрифицированных ооцитах коров при экстракорпоральном созревании. В экспериментах использовали ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) голштинизированного крупного рогатого скота (Bos taurus). Витрификации подвергались ооциты с гомогенной цитоплазмой, окруженные пятью и более слоями кумулюсных клеток. ОКК, предназначенные для витрификации, обрабатывали тремя растворами криопротекторных агентов (КПА), приготовленными на среде Т-199 с добавлением 10 % сыворотки крови плодов коров (FBS, «HyClone», Великобритания). В состав растворов КПА для витрификации ооцитов в контроле входили: в КПА-1 — 0,7 M диметилсульфоксид (DMSO) и 0,9 M этиленгликоль (EG); КПА-2 — 1,4 M DMSO и 1,8 M EG; КПА-3 — 2,8 M DMSO, 3,6 M EG и 0,65 M трегалоза. Растворы КПА, растворы для девитрификации и отмывания ооцитов в опыте дополняли наночастицами высокодисперсного кремнезема (нВДК, 4-17 нм, массовая концентрация 0,001 %), синтезированными посредством высокотемпературного гидролиза. В контроле нативные и девитрифицированные ооциты культивировали в течение 24 ч при 38,5 °C и 90 % влажности, в атмосфере, содержащей 5 % СО2. Среда имела следующий состав: Т-199 + 10 % FBS + 106 клеток/мл гранулезы + 50 нг/мл бычьего пролактина. Для культивирования нативныхи девитрифицированных ооцитов в опыте в эту среду добавляли нВДК (массовая концентрация 0,001 %). Для оценки функционального состояния митохондрий в нативных и ДВ ооцитах использовали зонд MitoTracker Orange CMTMRos («Thermo Fisher Scientific», Великобритания). В серии экспериментов по выявлению воздействия нВДК на ядерное созревание женских гамет ооциты помещали на 5-10 мин в 0,9 % раствор цитрата натрия и с помощью препаровальной иглы механически очищали от кумулюса. Затем клетки переносили на сухое обезжиренное стекло и фиксировали смесью метанол:уксусная кислота (3:1). Суховоздушные препараты окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. При воздействии нВДК в ДВ ооцитах возрастала интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (77±6,3 против 169±12,8 мкA, p < 0,05). Функциональная активность митохондрий ДВ ооцитов, обработанных нВДК, в период от стадии диплотены до стадии метафазы I увеличилась с 169±12,8 до 181±7,7 мкА (p < 0,05), в дальнейшем происходило ее снижение до 141±11,2 мкА, что, вероятно, связано с завершением ядерно-цитоплазматического созревания ооцитов. При оценке статуса хроматина ДВ ооцитов в группе, обработанной нВДК, было отмечено снижение числа клеток с признаками дегенерации хроматина на стадии диплотены и метафазы II по сравнению с интактными ДВ ооцитами (40 против 21 % и 59 против 38 %, p < 0.01), что, возможно, обусловлено процессами репарации ДНК. В целом выявлен положительный эффект 0,001 % нВДК в отношении показателей функциональной активности митохондрий и статуса хроматина в ДВ женских гамет Bos taurus.
Ключевые слова: ооцит, витрификация, наночастицы высокодисперсного кремнезема, функциональная активность митохондрий, MitoTracker Orange CMTMRos, хроматин, Bos taurus.
T.I. Kuzmina1, I.V. Chistyakova1, D.N. Tatarskaya2
Mitochondria are the only cellular compartments which generate and transform energy in the cell. These organelles are among the first to respond to changes in extra- and intracellular conditions (e.g., ionic homeostasis, dehydration level, temperature). Exposition to ultra-low temperatures, due to lipid peroxidation, causes ATP synthetase disorders and destruction of genetic material (E.A. Novocherkina et al., 2016). Highly dispersed silica nanoparticles (nHDS) can be proposed as cytoprotectors. An amorphous form of silicon dioxide, or highly dispersed silica, which exhibits its biological activity through high adsorption capacity, reduces the concentration of ions and biopolymers upon cell dehydration during cryopreservation, thus preventing a sharp change in the osmolar equilibrium between the intra- and extracellular environment (T.T. Turov et al., 2011). This paper deals with the first report of the increase in cryoresistance and maturation rate of donor Bos taurus oocytes due to exposure to nHDS during vitrification and in vitro culture, which ensures higher functional activity of mitochondria and preserves structural properties of chromatin of native and devitrified (DV) oocytes. The study aimed to identify the impact of nHDS on functional activity of mitochondria and chromatin state of cows’ native and devitrified oocytes during in vitro culture. In the experiments, we used oocyte-cumulus complexes (OCCs) of Holsteinized cows. The oocytes with homogeneous cytoplasm surrounded by five or more layers of cumulus cells were subjected to vitrification. OCCs intended for vitrification were successively exposed to three solutions of cryoprotective agents (CPAs) based on T-199 medium with 10 % fetal bovine serum (FBS, HyClone, Great Britain), the CPA-1 containing 0.7 M dimethyl sulfoxide (DMSO) + 0.9 M ethylene glycol (EG) (for 30 s), CPA-2 (1.4 M DMSO + 1.8 M EG (for 30 s), and CPA-3 (2.8 M DMSO + 3.6 M EG + 0.65 M trehalose) (for 20 s). The oocytes in straws were plunged into liquid nitrogen. After thawing, the oocytes were washed with T-199 medium containing 0.25 M, 0.19 M, and 0.125 M trehalose, and finally with T-199 medium. In the test group of oocytes, highly dispersed silica nanoparticles (nHDS, 4-17 nm, mass concentration 0.001 %) synthesized by high-temperature hydrolysis were added to the CPAs, devitrification solutions and washing solutions. In the control group, native and devitrified oocytes were cultured for 24 hours in maturation medium, the T-199 with 106 granulosa cells/ml supplemented with 10 % fetal bovine serum and 50 ng/ml bovine prolactin (38.5 °C, 90 % humidity, and 5 % CO2 atmosphere). In the test group, the maturation medium for native and devitrified oocytes was supplemented with nHDS at a final concentration of 0.001 %. Mitochondrial activity was measured by fluorescence intensity (FI) of MitoTracker Orange CMTMRos (Thermo Fisher Scientific, UK) in µA. In a series of experiments on identification of the nHDS effects on the nuclear maturation of female gametes, oocytes were exposed for 5-10 min to 0.9 % sodium citrate solution and mechanically released from cumulus cells with a preparation needle. Then the cells were placed on a glass slide and fixed with methanol:acetic acid solution (3:1). The dry-air preparations were stained with azure-eosin by Romanovsky-Giemsa method. In DV oocytes influenced by nHDS, the FI of MitoTracker Orange CMTMRos probe increased from 77±6.3 μA to 169±12.8 μA (p < 0.05). The functional activity of mitochondria of DV oocytes treated with nHDS increased from 169±12.8 μA to 181±7.7 μA (p < 0.05) during the diplotene to the metaphase I stages, and subsequently decreased to 141±11.2 μA at metaphase II stage, what is probably associated with the completion of nuclear and cytoplasmic maturation of oocytes. When assessing the chromatin state of oocytes in the nHDS-treated group, we revealed a decrease in the number of oocytes with chromatin degeneration at diplotene and metaphase II stages compared to those in the nHDS-untreated DV oocytes (40 % vs. 21 %, and 59 % vs. 38 %, p < 0.01), that is probably associated with the DNA repair. In general, our findings reveal a positive effect of nHDS on the functional activity of mitochondria and the chromatin state in DV female gametes of Bos taurus. The obtained results expand views and available information on the functioning of cell compartments at ultra-low temperatures and the mechanisms of nHDS action on female gametes.
Keywords: oocyte, vitrification, highly dispersed silica nanoparticles, functional activity of mitochondria, MitoTracker Orange CMTMRos,chromatin, Bos taurus.
| 1Всероссийский НИИ генетики и разведения |
Поступила в редакцию |
