УДК 636.082:573.6.086.83:57.08
doi: 10.15389/agrobiology.2015.4.420rus
Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота методом zona-free NT проводилось под руководством академика РАСХН М.И. Прокофьева в отделе «Биотехцентр» НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева (Московская обл., Ленинский р-н, Горки Ленинские) при финансовой поддержке ООО «Биолайн Фармторг» (г. Москва).
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ZONA-FREE
ПРИ КЛОНИРОВАНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
(обзор)
Г.П. МАЛЕНКО1,2, А.В. КОМИССАРОВ3, О.И. СТЕПАНОВ1,
Г.Ю. КОСОВСКИЙ1
В современной биотехнологии широко дискутируется тема создания клонов млекопитающих. В представленном обзоре на основании данных литературы и результатов собственных исследований рассмотрены успехи и проблемы трансплантации ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT), используемой для этих целей, проведен сравнительный анализ традиционной процедуры SCNT и метода zona-free nuclear transfer (zona-free NT). Основные области применения SCNT — терапевтическое и репродуктивное клонирование, получение трансгенных животных, сохранение редких и исчезающих видов, фундаментальные исследования. Так, клонирование элитных быков-производителей позволяло бы воссоздавать их уникальный генетический материал, что невозможно при естественном воспроизводстве. Однако пока что клонирование животных не получило широкого распространения. Одна из причин — низкий выход здорового молодняка, который у крупного рогатого скота, например, составляет в среднем около 9 % от числа трансплантированных клонированных эмбрионов. Считается, что отклонения в развитии плода обусловлены нарушениями, имевшимися в процессе репрограммирования ядра соматической клетки. Хотя в настоящее время предложено несколько практических подходов, позволяющих повысить эффективность метода SCNT, проблема репрограммирования ядра как фундаментальный вопрос биологии развития требует дальнейшего глубокого изучения. Кроме того, проблемой, сдерживающей практическое применение метода SCNT, остается сложность исполнения манипуляций, предусмотренных традиционной технологией, которая была предложена около 30 лет назад S.M. Willadsen (1986) и используется до настоящего времени практически в неизмененном виде. Вместе с тем существенный прогресс был достигнут при клонировании млекопитающих по так называемому zona-free NT методу, когда ооциты перед энуклеацией освобождают от блестящей оболочки. Впервые этот прием был успешно применен T.T. Peura с соавт. (1998), донорами ядер бластомеров в их работе служили эмбрионы крупного рогатого скота. Метод оказался эффективен и при использовании соматических клеток для получения клонированных эмбрионов свиньи (P.J. Booth, 2001), овцы (T.T. Peura, 2003), крупного рогатого скота (P.J. Booth с соавт., 2001), лошади (C. Galli с соавт., 2003). Zona-free NT метод был усовершенствован нами при получении клонированных эмбрионов крупного рогатого скота (Г.П. Маленко с соавт., 2006). В доступных источниках мы не встречали сообщений об использовании zona-free NT другими исследователями в России, хотя в мировой литературе признается, что по сравнению с традиционными приемами он более производителен, проще в исполнении и дает воспроизводимые результаты (I. Lagutina с соавт., 2007; B. Oback с соавт., 2007). При подготовке цитопластов энуклеация ооцитов без блестящей оболочки может проводиться без применения ядерных флуоресцентных красителей при эффективности 95-100 % и сохранении 96-97 % объема ооплазмы (M.I. Prokofiev с соавт., 2007). Частота электрослияния цитопластов без блестящей оболочки с соматическими клетками составляет 95-100 % (I. Lagutina с соавт., 2007; G.P. Malenko с соавт., 2007) по сравнению с 60-70 % при традиционном методе (I. Lagutina с соавт., 2007). Выход бластоцист оказывается равен или превышает этот показатель по сравнению с традиционным методом, результаты трасплантации также сопоставимы. Технология zona-free NT благодаря простоте исполнения и высокой результативности основных этапов рассматривается как эффективный протокол при создании клонированных эмбрионов сельскохозяйственных животных с целью получения жизнеспособного молодняка.
Ключевые слова: трансплантация ядер соматических клеток, метод zona-free, энуклеация, электрослияние, сельскохозяйственные животные.
PERSPECTIVE OF ZONA-FREE METHOD USE IN FARM ANIMAL
CLONING
(review)
G.P. Malenko1, 2, A.V. Komissarov3, O.I. Stepanov1, G.Yu. Kosovskii1
The review is dedicated to one of the relevant and widely discussed topics of modern biotechnology, namely cloning of mammals. Particularly, the success and problems of the somatic nuclear transfer (SCNT) are discussed herein. The advantages and disadvantages of a commonly used SCNT and zona-free modification are compared based on special publications and the data obtained in our experiments. The most promising targets for the SCNT are reproductive cloning, therapeutic cloning and fundamental science. Conservation of rare and endangered species is also in focus. Nevertheless, to date the cloning application is still relatively limited. One of the reasons is a low yield of healthy offspring in mammals, for example, average yield in cattle is about 9 % of cloned embryo transfers result in birth of healthy offspring. It is assumed that deviations in the development of cloned fetuses are caused by disorders in genomic reprogramming of a somatic cell nucleus, which results in significant disturbance of gene expression particularly in placenta. Even though there are several practical techniques that allow to increase effectiveness of SCNT, reprogramming of the nucleus demands further study as one of the fundamental problems of developmental biology. Second problem that hinders practical application of SCNT method is complexity of the conventional technique, which was introduced about 30 years ago by S.M. Willadsen (1986). Since then the technique has been applied almost without any variations. At the same time significant progress has been achieved in the so called zona-free nuclear thansfer method (zona-free NT), where oocytes are freed from zona pellucida before enucleation. This method was successfully applied for the first time by T.T. Peura et al. (1998). They used blastomeres of bovine embryo for electrofusion. The method was also effective for creation of cloned embryos of pig (P.J. Booth, 2001), sheep (T.T. Peura, 2003), cow (P.J. Booth et al., 2001), horse (C. Galli et al., 2003) using somatic cells. We have improved zona-free NT method for cattle embryo cloning (G.P. Malenko et al., 2006). In the available publications there are no references about zona-free NT use by other researches in Russia while worldwide it is considered more simple, effective and reproducible method compared to a conventional one (I. Lagutina с соавт., 2007; B. Oback с соавт., 2007). Preparation of cytoplasts by enucleation of zona-free oocytes can be carried out without fluorescent dyes with effectivness of 95-100 % and preservation of 96-97 % of ooplasm volume (M.I. Procofiev et al., 2007). Electrofusion rate of zona-free cytoplasts and somatic cells is 95-100 % (I. Lagutina et al., 2007; G.P. Malenko et al., 2007) compared to 60-70 % achieved during conventional cloning (I. Lagutina et al., 2007). Blastocyst yield is equal or higher then yield produced by the conventional method. Embryo transfer results are comparable for both methods. Zona-free NT method may further increase the output of cloned embryos and offspring of the farm animals due to the simplicity and high effectiveness. Since the unique gene combinations of elite bulls’ genotypes can not been copied by natural reproduction, their cloning is promising, particularly by means of zona-free NT—SCNT. SCNT application also seems to be the most prospective in animal transgenesis.
Keywords: somatic cell nuclear transfer, zona-free method, enucleation, electrofusion, farm animals.
1ФГБНУ Центр экспериментальной эмбриологии
|
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
