doi: 10.15389/agrobiology.2023.6.1100rus
УДК 636.2:591.39
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-16-00115-П).
ПРИСУТСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В СРЕДЕ СОЗРЕВАНИЯ ДОНОРСКИХ ООЦИТОВ КОРОВ ПОВЫШАЕТ ИХ СПОСОБНОСТЬ К ЭМБРИОНАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ in vitro
Г.Н. СИНГИНА1✉, Е.Н. ШЕДОВА1, R. UZBEKOV2, 3, Р.Ю. ЧИНАРОВ1,
В.А. ЛУКАНИНА1, S. UZBEKOVA4
Технология получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVEP) с использованием ооцитов, выделенных посредством трансвагинальной пункции фолликулов (ovum-pickup, OPU) позволяет получать большее число потомков от лучших матерей и все чаще используется в скотоводстве в программах по тиражированию и сохранению ценных генотипов. Для повышения эффективности OPU/IVEP-технологии в представленной работе мы впервые культивировали OPU-ооциты коров в присутствии внеклеточных везикул (extracellular vesicles, EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) яичников коров и определили способность таких ооцитов к эмбриональному развитию in vitro после экстракорпорального оплодотворения. Цель работы заключалась в изучении влияния EVs на OPU-ооциты коров с точки зрения их созревания и последующей способности развиваться до стадии бластоцисты, а также устойчивости полученных бластоцист к замораживанию. EVs из ФЖ выделяли методом дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования при 100000 g. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила, что в выделенных препаратах присутствуют EVs, соответствующие по размерам экзосомам. Донорами ооцитов были половозрелые телки ярославской породы (n = 6) с естественным половым циклом. OPU проводили 2 раза в неделю. Для созревания выделенные ооциты культивировали в среде ТС-199, дополненной фетальной бычьей сывороткой (10 %), фолликулостимулирующим и лютеинизирующим (10 мкг/мл) гормонами, эпидермальным фактором роста (10 нг/мл) в отсутствие (контроль) или в присутствии EVs (опыт). Везикулярный белок добавляли в среду in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) в физиологической концентрации (на 1 мл среды — количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ооциты подвергали экстракорпоральному оплодотворению и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Бл). Полученные Бл замораживали, некоторое время хранили при -196 °С, после чего размораживали и культивировали до стадии вылупления, определяя жизнеспособность эмбрионов. Всего провели 10 независимых экспериментов. Число ооцитов в контроле и опыте было одинаковым и составило соответственно 57 и 56 клеток. Мы не выявили влияния условий культивирования на завершение ядерного созревания. Доля созревших ооцитов была сходной в обеих группах и составила в контроле и опыте соответственно 90,4±5,6 и 94,3±3,1 %. Также присутствие EVs в среде IVM не изменяло долю раздробившихся ооцитов после оплодотворения in vitro, которая составила 78,6±7,3 и 86,7±4,9 % соответственно для контроля и опыта. Тем не менее обнаружено положительное влияние EVs на развитие созревших ооцитов до стадии Бл. При культивировании OPU-ооцитов в контрольной среде выход Бл составлял 26,6±5,81 %. Введение EVs в среду IVM повышало этот показатель до 41,2±3,2 % (p < 0,05). Также обнаружено влияние (на уровне тенденции) везикул на криоустойчивость полученных Бл. В контроле процент вылупления Бл после их размораживания и кратковременного культивирования составил 29,1±8,8 %, в опыте он возрастал до 53,3±9,2%. Таким образом, использование EVs из ФЖ яичников коров в процедуре IVM повышает качество ооцитов и, как следствие, их компетенцию к эмбриональному развитию после экстракорпорального оплодотворения. Следовательно, EVs из ФЖ на этапе экстракорпорального созревания могут быть использованы для повышения эффективности OPU/IVEP технологии у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: внеклеточные везикулы, фолликулярная жидкость, ооциты коров, in vitro созревание, эмбриональное развитие.
G.N. Singina1 ✉, E.N. Shedova1, R. Uzbekov2, 3,
R.Yu. Chinarov1, V.A. Lukanina1, S. Uzbekova4
In vitro embryo production (IVEP) technology from the oocytes isolated by transvaginal follicle puncture (ovum-pickup, OPU) is widely used to generate a number of descendants from the most valuable donor cows and becomes a routine in cattle breeding programs to replicate and conserve precious genotypes. To increase the efficiency of OPU/IVEP-technology, in this work for the first time, bovine OPU-oocytes were matured in the presence of extracellular vesicles (EVs) from follicular fluid (FF), and the ability of treated oocytes to IVEP after in vitro fertilization was investigated. The aim was to study the effects of FF EVs on oocyte maturation and capacity to develop up to blastocyst of OPU-oocytes, as well as to resistance of such blastocysts to freezing. EVs were obtained from FF by differential centrifugations followed by ultracentrifugation at 100,000 g. The preparations were analyzed by transmission electron microscopy that confirmed the presence of exosome-size EVs. Oocyte donors were sexually mature Yaroslavl breed heifers (n = 6) following natural cycle. OPU was performed twice a week. The isolated oocytes were in vitro matured in TC-199 medium, supplemented by fetal bull serum (10 %), follicle stimulating and luteinizing (10 mg/ml) hormones, epidermal growth factor (10 ng/ml) in absence (control) or presence of EVs (experiment). Vesicular preparations were added to the in vitro maturation (IVM) medium in the physiological concentration (EVs isolated from 1 ml of FF per 1 ml of medium). After 24 hours of IVM, the oocytes were subjected to in-vitro fertilization and in vitro embryo culture. At day 3 after fertilization, oocyte morphology was checked, and at day 7 of culture, a number of embryos developed to blastocyst (Bl) was determined. The resulting Bl were frozen and stored for some time at -196 °С. Then the blastocysts were thawed and in vitro cultured until hatching to determine their viability. A total of 10 independent experiments were performed, 57 and 56 oocytes were analyzed in control and treatment, respectively. No impact of experimental conditions on nuclear maturation rate was evidenced. The mature oocytes were similar in control and EVs-treated groups and accounted for 90.4±5.6 % and 94.3±3.1 %, respectively. In addition, the presence of EVs during IVM did not change oocyte cleavage rate after vitro fertilization, 78.6±7.3 % and 86.7±4.9 % in control and EV-treated groups, respectively. However, beneficial effect of EVs on blastocyst rate was found. In control, 26.6±5.8 % of OPU oocytes developed to Bl. EVs added during IVM increased blastocyst rate to 41.2±3.2 % (p < 0.05). EVs also tended to increase cryoresistance of resulting blastocysts. In control, blastocyst hatching rate after thawing and short-term culture was 29.1±8.8 % and increased to 53.3±9.2% in the EVs group. Thus, addition of EVs from cow follicular fluid during IVM culture increases oocyte quality and, consequently, their competence to embryo development after in vitro fertilization. Therefore, using of follicular fluid EVs during in vitro maturation of OPU oocytes can improve the efficiency of OPU/IVEP technologies in cattle.
Keywords: extracellular vesicles, bovine follicular fluid, bovine oocytes, in vitro maturation, oocyte aging, embryo development.
1ФГБНУ Федеральный исследовательский центр |
Поступила в редакцию |
