doi: 10.15389/agrobiology.2023.6.1088rus
УДК 636.3:591.391.1:57.085.23
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ТРАСПЛАНТАЦИИ IVEP ЭМБРИОНОВ У ОВЕЦ (Ovis aries)
Г.Н. СИНГИНА ✉, В.А. ЛУКАНИНА, Е.Н. ШЕДОВА,
Р.Ю. ЧИНАРОВ, Е.А. ГЛАДЫРЬ, Е.В. ЦЫНДРИНА
Необходимость развития технологии получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVEP) у овец обусловлена ее использованием в исследованиях по разведению и сохранению ценных животных, а также созданию новых генотипов методом геномного редактирования. В представленной работе впервые для отечественной практики сообщается о получении in vitro у овец полноценных эмбрионов и рождении живого потомства после их трансплантации животным-реципиентам. Цель исследования заключалась в разработке основных этапов технологии IVEP у вида Ovis aries и оценке ее эффективности в условиях in vitro и in vivo. Источником половых клеток самок служили яичники половозрелых ярок и овцематок разной породной принадлежности и возраста, полученные после убоя (post mortem). Видимые фолликулы рассекали и выделяли ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) (n = 1028). Отобранные по качеству ОКК (n = 620) культивировали группами по 25-35 шт. в течение 24 ч в 500 мкл среды ТС-199, дополненной 10 % фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего и 10 мкг/мл лютеинизирующего гормонов, 10 нг/мл эпидермального фактора роста. Часть созревших яйцеклеток (n = 96) использовали для цитологического анализа степени ядерного созревания, оставшуюся часть (n= 524) переносили в среду BO-IVF («IVF Bioscience», Великобритания) для экстракорпорального оплодотворения. Гранулы замороженной спермы барана породы катадин размораживали и обрабатывали методом swim-up с использованием среды Sperm-TALP (G.N. Singina, 2019). Созревшие ооциты овец культивировали совместно со сперматозоидами в среде BO-IVF в течение 15-16 ч, после чего их переносили в среду эмбрионального развития BO-IVС («IVF Bioscience», Великобритания). Через 2 сут инкубации оценивали раздробившиеся эмбрионы, часть из них трансплантировали животным-реципиентам, на 7-е сут определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты. Двухсуточные эмбрионы пересаживали синхронным по половому циклу яркам романовской породы (n = 6) эндохирургически (В.А. Луканина с соавт., 2023) методом двухпортовой лапароскопии под местной анестезией. Через 35-42 сут с момента трансплантации эмбрионов овец-реципиентов исследовали на суягность и затем вели наблюдение за развитием у них плодов вплоть до рождения живого потомства. По результатам цитологического анализа доля ядерного созревания ооцитов составила 77,1 % (74 из 96). Из 524 созревших и оплодотворенных ооцитов 316 клеток (60,3 %) преодолели первое деление дробления. Животным-реципиентам пересадили 92 раздробившихся эмбриона. Из 224 оставшихся и продолживших развитие in vitro ранних эмбрионов 34,8 % достигли стадии бластоцисты. По данным ультразвуковой диагностики, доля суягных животных после трансплантации эмбрионов шести реципиентам составила 50 % (3 из 6), 33,3 % пересадок (2 из 6) завершились рождением живого потомства. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об эффективности применяемой IVEP технологии: получаемые с ее использованием эмбрионы полноценны и способны развиваться до жизнеспособного потомства. Есть все основания полагать, что предложенная технология получения эмбрионов in vitro и их трансплантации животным-реципиентам может быть применена на практике в работах по воспроизводству и геномному редактированию у овец.
Ключевые слова: Ovis arie, домашняя овца, ооциты, in vitro созревание, in vitro оплодотворение, эмбрионы, IVEP, трансплантация.
THE RESULTS OF PRODUCTION AND TRANSPLANTATION OF IVEP EMBRYOS IN SHEEP (Ovis aries)
G.N. Singina ✉, V.A. Lukanina, E.N. Shedova, R.Yu. Chinarov,
E.A. Gladyr, E.V. Tsyndrina
In vitro embryo production (IVEP) in sheep is necessary to develop because of its use in breeding and conservation of valuable animals and possible creation of new genotypes by genomic editing. In the present work for the first time in national practice, full-fledged ovine embryos were produced in vitro and live lambs were born after their transplantation to recipient ewes. The aim of this work was to model the main steps of IVEP technology in this species, and to evaluate its efficiency in vitro and in vivo. Female germ cells were obtained post mortem from the ovaries of sexually mature ewes and sheep of various breeds and ages after slaughtering. Oocyte-cumulus complexes (OCC) (n = 1028) were retrieved by dissecting of visible follicles and only high-quality OCC (n = 620) were cultured for 24 h, 25-35 OCC per 500 ml of ТС-199 medium supplemented by 10 % fetal calf serum, 10 mg/ml of FSH and 10 mg/ml LH, 10 ng/ml of epidermal growth factor. A part of mature oocytes (n = 96) was used for cytological analysis of nuclear maturation rate, and other oocytes (n = 524) were transferred to BO-IVF medium (IVF Bioscience, UK) for in vitro fertilization. The granules of Katadin breed ram frozen semen were thawed and treated by “swim-up” method in Sperm-TALP medium (G.N. Singina, 2019). Mature oocytes were co-cultured with ram sperm in BO-IVF for 15-16 hours and then were transferred to BO-IVS medium (IVF Bioscience, UK) for in vitro embryo development. At day 2 of culture, cleavage rate was evaluated and a part of cleaved embryos was transplanted to recipient animals; at day 7, development to blastocyst occurred. Two-day embryos were transplanted synchronously to cycling Romanov breed ewes (n = 6) by endoscopic surgical method (V.A. Lukanina et al., 2023) using two-port laparoscopy under local anesthesia. After 35-42 days of transplantation, recipient ewes were examined for pregnancy, and fetus development was monitored until live lamb birth. According to cytological analysis, oocyte nuclear maturation rate was 77.1 % (74/96), 316 out of 524 mature and fertilized oocytes were cleaved (60.3 %), and 92 cleaved embryos were transplanted to recipient animals. Remaining early embryos (n = 224) continued in vitro development and 34.8 % reached blastocyst stage. According to ultrasound diagnostics after embryo transplantation, pregnancy rate was 50 % (3/6), and 33.3 % (2/6) transplantations resulted in live offspring. Thus, reported data demonstrated efficiency of IVEP technology in sheep: produced embryos were full-fledged and capable to develop to viable offspring. There is a good reason to believe that proposed technology of in vitro embryo production and transplantation to recipient ewes can be applied to reproduction technologies and gene editing in ovine.
Keywords: Ovis arie, domestic sheep, oocytes, in vitro maturation, in vitro fertilization, embryos, IVEP, transplantation.
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр |
Поступила в редакцию |
