doi: 10.15389/agrobiology.2023.6.1112rus
УДК 619:57.085.23
Работа выполнена в рамках НИР FGUG 2022-0010 «Содержание и развитие коллекций культур клеток и микроорганизмов на основе фундаментальных исследований, создание штаммов бактерий и вирусов с заданными свойствами для использования в ветеринарии методами биотехнологии, в том числе на основе клеточных нанобиотехнологий, совершенствования диагностики и средств специфической профилактики инфекционных заболеваний».
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ, В ТОМ ЧИСЛЕ ЭКЗОСОМЫ, ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ/СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ
И.П. САВЧЕНКОВА✉, Г.А. НАДТОЧЕЙ
Мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК) млекопитающих продуцируют внеклеточные везикулы (ВВ), связанные с плазматической клеточной мембраной, в которых могут присутствовать факторы роста, хемокины, цитокины, микроРНК. В настоящее время ВВ широко используются для разработки новых регенеративных стратегий в лечении многочисленных заболеваний, поскольку передают большую часть терапевтических свойств МСК. В исследовании впервые показано, что из кондиционированных сред (КС) МСК пяти разных видов животных можно выделить обогащенные экзосомами ВВ методом дифференциального центрифугирования (ДЦ) с последующим ультрацентрифугированием (УЦ). Цель работы — получить внеклеточные везикулы из кондиционированных сред мезенхимных стволовых/стромальных клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани сельскохозяйственных (крупный рогатый скот, овцы, лошади) и мелких домашних (собаки, кошки) животных. В работе использовали МСК, полученные нами ранее из костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (КРС) и овец, пуповинной крови (ПК) лошадей, жировой ткани (ЖТ) овец, КРС, лошадей, собак и кошек. МСК размораживали и засевали в матрасы с площадью роста 25 см2, через 48 ч пересевали в матрасы с площадью роста 175 см2 в соотношении 1:7 и инкубировали в течение 10 сут до достижения клеткам полного монослоя. Затем КС из всех образцов МСК сливали в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл и выделяли ВВ. Для этого использовали метод дифференциального центрифугирования (ДЦ) с последующим ультрацентрифугированием (УЦ). Во всех образцах с помощью электронной микроскопии были выявлены округлые или не совсем правильной формы микрочастицы разного размера. Диаметры отдельных ВВ у разных видов животных статистически не различались (p = 0,1). При сравнении числа частиц, выделенных из 50 мл КС МСК разных видов животных, статистически значимых различий не выявили (р = 0,1). Так, на одной сетке МСК (КМ) и МСК (ЖТ) КРС обнаружили соответственно 3±0,1 и 6±0,07 частицы размером 50-100 нм, 7±0,02 и 4±0,03 частицы 100-150 нм, а также 3±0,4 и 2±0,06 частицы размером более 150 нм. ВВ из КС МСК (ЖТ) собак были наиболее гомогенными и по форме (округлые), и по размеру (основная часть имела размер 50-100 нм; 12±0,02 частиц). В образцах, выделенных из КС МСК (ЖТ) овец, кошек, лошадей и ПК лошадей, число частиц с диаметром 50-100 нм составляло 7±0,2; 7±0,01; 5±0,7 и 8±0,02. Анализ полученных электронограмм показал, что более 70 % ВВ имели диаметр от 50 до 100 нм, то есть классифицировались как экзосомы. ВВ, выделенные из КС МСК (ЖТ) собак, положительно окрашивались при использовании антител против антигена TSG101 (цитоплазматический белок, маркер экзосом). Полученные результаты демонстрируют, что КС МСК животных, выделенных из КМ, ЖТ и ПК, содержит ВВ, в том числе экзосомы. Метод ДЦ не исключает, что в препарате присутствуют другие частицы, поэтому мы предлагаем обозначить его как микро-ВВ, обогащенные экзосомами. Получение ВВ определенного состава из КС МСК сельскохозяйственных и домашних животных открывает широкие перспективы для применения экзосом в диагностике и лечении заболеваний.
Ключевые слова: мезенхимные стволовые/стромальные клетки, костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, лошади, крупный рогатый скот, овцы, собаки, кошки, внеклеточные везикулы, экзосомы, выделение, дифференциальное центрифугирование, идентификация.
EXTRACELLULAR VESICLES INCLUDING EXOSOMES FROM ANIMAL MESENCHYMAL STEM/STROMAL CELLS
I.P. Savchenkova ✉, G.A. Nadtochey
Mammalian mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) produce extracellular vesicles (EVs) associated with the plasma cell membrane, which may contain growth factors, chemokines, cytokines, and microRNAs. Currently, EVs are widely used to develop new regenerative strategies in the treatment of numerous diseases, since they convey most of the therapeutic properties of MSCs. This work shows for the first time that EVs enriched with exosomes can be isolated from conditioned media (CM) of MSCs from five different animal species using the method of differential centrifugation (DC) followed by ultracentrifugation (UC). The purpose of the work is to obtain EVs from conditioned media (CM) of MSCs of bone marrow (BM), umbilical cord blood (UCB) and adipose tissue (AT) of agricultural (cattle, sheep, horses) and small domestic animals (dogs, cats). We used MSCs that were previously obtained from the bovine and ovine BM, equine UCB, ovine, bovine, equine, canine and feline AT. MSCs were thawed and seeded into 25 cm2 growth area flasks, after 48 hours they were reseeded into 175 cm2 growth area flasks in a ratio 1:7 and incubated for 10 days until the cells reached a complete monolayer. Then the CM from all MSC samples was poured into 50 ml sterile centrifuge tubes and EVs were isolated. For this purpose, we used the method of DC followed by UC. In all samples, electron microscopy revealed round or irregularly shaped microparticles of different sizes. The diameters of individual EVs did not differ statistically between different animal species (p = 0.1). When comparing the number of particles isolated from 50 ml of CM from MSCs of different animal species, no statistically significant differences were detected (p = 0.1). Thus, on one mesh of bovine MSC(BM) and MSC(AT), 3±0.1 and 6±0.07 particles with a size of 50-100 nm, 7±0.02 and 4±0.03 particles of 100- 150 nm, as well as 3±0.4 and 2±0.06 particles larger than 150 nm. EVs from CM of canine MSC(AT) were the most homogeneous in both shape (round) and size, and the main part was found in the range of 50-100 nm (12±0.02 particles). In samples isolated from the CM of ovine, bovine, equine MSC(AT) and equine MSC(UCB), the number of particles with a diameter of 50-100 nm was 7±0.2; 7±0.01; 5±0.7 and 8±0.02. Analysis of the obtained electron diffraction patterns showed that more than 70 % of EVs had a diameter from 50 to 100 nm, that is, they were classified as exosomes. EVs isolated from CM canine MSC were positively stained with antibodies against the TSG101 antigen (cytoplasmic protein, exosome marker). The results obtained demonstrate that the CM of animals MSCs, isolated from BM, AT and UCB contains EVs, including exosomes. The DC method does not exclude the possibility that other particles are present in the preparation, so we propose to designate the result obtained as micro explosives enriched with exosomes. Obtaining EVs of a certain composition from the CM of agricultural and domestic animal MSCs opens up broad prospects for the use of exosomes in the diagnosis of diseases and treatment of agricultural and domestic animals.
Keywords: mesenchymal stem/stromal cells, bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, horses, cattle, sheep, dogs, cats, extracellular vesicular, exosomes, isolation, differential centrifugation, identification.
ФГБНУ ФНЦ Всероссийский НИИ экспериментальной |
Поступила в редакцию |
