doi: 10.15389/agrobiology.2018.6.1274rus
УДК 636.087.8:573.6.086.83:577.15
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и поддержана грантом РНФ № 16-16-04062.
ПРОТЕИНАЗА БАЦИЛЛ НА ОСНОВЕ ГЕННОЙ КОНСТРУКЦИИ
КАК КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ПТИЦЕВОДСТВА
А.О. КОРЯГИНА, Н.Л. РУДАКОВА, М.Т. ЛУТФУЛЛИН, Г.Ф. ХАДИЕВА,
А.А. ТОЙМЕНЦЕВА, А.М. МАРДАНОВА, М.Р. ШАРИПОВА
Усвояемость питательных пищевых веществ рациона и, как следствие, его удешевление определяются не только составом и активностью ферментов в организме, но и кормовыми ферментными добавками. Применение бактериальных ферментов, в частности протеиназ, в качестве биодобавок в птицеводстве активно развивается. Расщепляя белки, протеиназы повышают их доступность (как следствие, экономятся средства на приобретение синтетических аминокислот) и снижают негативный эффект ингибиторов пищеварения. Биотехнологии получения ферментов основаны на применении бактерий или микроскопических грибов, при этом для увеличения выхода и направленного воздействия на свойства продукта используются методы генной инженерии. Бактериальные сериновые протеиназы обладают высокой термостабильностью и устойчивы к ингибиторам животного происхождения. В настоящем сообщении мы впервые представляем данные о получении высокоочищенной секретируемой субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacilluspumilus при экспрессии рекомбинантного вектора в штаммах B. subtilisи приводим основные физико-химические и биологические характеристики синтезируемого продукта. Цель нашего исследования — получение с использованием экспрессионной системы высокоочищенной субтилизиноподобной сериновой протеиназы B. pumilus как перспективной кормовой добавки для птицеводства. Показано, что у полученной сериновой протеиназы субстратная специфичность по глубине осуществляемого гидролиза соответствует таковой у субтилизинов, фермент расщепляет связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот лейцина, фенилаланина и тирозина, а также ряда гидрофильных аминокислот. Исследование влияния температуры и рН на активность этой сериновой протеиназы показало, что в присутствии ионов кальция в конечной концентрации 5 мМ температурный оптимум фермента достигает 50 °С. Фермент сохранял стабильность в интервале рН от 7 до 10. При определении активности рекомбинантой протеиназы при значениях рН, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта кур, оказалось, что в слабокислой среде (рН 5,5, зоб) активность сохраняется полностью (100 %), при рН 2,9 (желудок) активность фермента снизилась на 40 %, а при переходе снова в щелочные условия рН 6,5-8,0 (тонкий и толстый кишечник) активность фермента восстанавливалась и возрастала относительно контроля на 13 %. Таким образом, фермент способен оставаться в активном состоянии на всем протяжении пищеварительного тракта. Активность протеиназы не подавлялась природными ингибиторами, например, ингибитором трипсина, что позволит ферменту функционировать в желудочно-кишечном тракте кур. При воздействии куриной желчи в концентрациях от 0,01 % до 0,05 % в течение 1 ч при 40 °С активность микробной протеиназы полностью сохранялась, а при увеличении концентрации куриной желчи до 1 % наблюдали снижение активности фермента на 10 %. Токсичность протеиназы оценили на 1-суточных цыплятах-бройлерах кросса Cobb 500 при наблюдении в течении 10 сут. Бактериальная протеиназа в дозе 100 EU/кг корма не обладала токсичностью, физиологические показатели птицы оставались в норме. Нами установлено, что на ранних стадиях выращивания цыплят (0-10 сут) эффективно добавление протеиназы в комбикорм Старт в дозе 5 EU/кг корма. На поздних стадиях роста птицы (21-42 сут) при использовании комбикорма Финишер эффективно повышение дозы бактериальной протеиназы до 15 EU/кг. В обоих случаях добавление протеиназы позволяет повысить прирост биомассы птицы (соответственно на 13,9 % и 7,9 %), а также улучшает конверсию корма (на 14 % и 8,5 %). Таким образом, количество вносимого фермента необходимо корректировать в зависимости от возраста птицы и состава комбикорма. Основные показатели развития цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 при применении рекомбинантной протеиназы позволяют сделать заключение о ее перспективности в качестве кормовой добавки.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, рекомбинантная субтилизиноподобная сериновая протеиназа, субстратная специфичность, стабильность, активность, влияние pH и температуры, кормовая добавка, цыплята-бройлеры, Cobb 500.
GENE CONSTRUCT-BASED SERINE PROTEASE OF Bacillus pumilus AS A FEED ADDITIVE FOR POULTRY FARMING
A.O. Koryagina, N.L. Rudakova, M.T. Lutfullin, G.F. Khadieva,
A.A. Toymentseva,
A.M. Mardanova, M.R. Sharipova
Bacterial enzymes, in particular proteinases, as dietary additives in poultry farming, improve digestibility of feed nutrients and, as a consequence, make animal diets cheaper. This explains why bioadditives are being actively developed worldwide. Proteinаses break down proteins and reduce the negative effect of digestive inhibitors thus allow the costs for purchasing synthetic amino acids to be lower. Bacteria and microscopic fungi, including those with gene constructs developed to increase yield and improve properties of the expressed enzymes, may be producers. Bacterial serine proteinases have a high thermostability and are resistant to inhibitors of animal origin. In this paper, we report for the first time about the production of highly purified secreted subtilisin-like serine proteinase from Bacillus pumilus upon expression of the recombinant vector in B. subtilis strains and evaluate the main physicochemical and biological characteristics of the synthesized product. The goal of our study is to obtain, by using the expression system, the highly purified subtilisin-like serine proteinase from B. pumilus as a promising feed additive for the poultry industry. The substrate specificity of the produced serine proteinase, i.e. the depth of hydrolysis, corresponds to the specificity of subtilisins, the enzyme cleaves the bonds formed by the carboxyl groups of the hydrophobic amino acids leucine, phenylalanine and tyrosine, as well as a number of hydrophilic amino acids. An investigation of the effect of temperature and pH on serine proteinase activity showed that in the presence of calcium ions at a final concentration of 5 mM, the temperature optimum of the enzyme reached 50 °С. The enzyme remaines stable in the pH range from 7 to 10. The proteinase activity was studied at various pH values to simulate the conditions of the gastrointestinal tract of chickens. In a weakly acidic medium (pH 5.5, goiter) proteinase completely retains its activity (100 %), at pH 2.9 (stomach) the enzyme activity decreases by 40 %, and upon transition again to alkaline conditions (pH 6.5-8.0, small intestine and large intestine), the enzyme restores activity up to the values exceeding control by 13 %. Thus, the enzyme can remain active throughout the whole digestive tract of broiler chicks. The proteinase activity was not inhibited by natural inhibitors, such as a trypsin inhibitor, which would also allow the enzyme to function in the gastrointestinal tract of chickens. In experiments on the effect of chicken bile from 0.01 % to 0.05 % for 1 hour at 40 °С on the microbial proteinase, the enzyme completely preserved its activity. With an increase in the concentration of chicken bile to 1 %, the enzyme activity decreased by 10 %. To study the toxicity of proteinase, 1-day-old Cobb 500 broiler chickens were observed for 10 days. The dietary proteinase at 100 EU/kg concentration showed no toxicity, and all the indices of the poultry remained normal. We found that in the early period, during 0-10 days of growth when the chickens are fed with Start ration, a dosage of 5 EU/kg of proteinase is effective. In the late stages of poultry growth (21-42 days), the use the Finisher mixed feed supplemented with bacterial proteinase at a dose of 15 EU/kg is optimal. In both cases, the dietary proteinase increases poultry weight gain by 13.9 % and 7.9 %, and also improves feed conversion by 14 % and 8.5 %, respectively. Thus, the amount of the introduced enzyme must be adjusted depending on the age of birds and the feed composition. The main indicators of Cobb 500 broiler chickens’ growth when using recombinant proteinase allow us to conclude that this proteinase is promising as a feed additive.
Keywords: Bacillus pumilus, recombinant subtilisin-like serine proteinase, substrate specificity, stability, activity, effects of pH and temperature, fodder additive, broiler chickens, Cobb 500.
ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный |
Поступила в редакцию |
