doi:10.15389/agrobiology.2016.6.824rus
УДК 636.2:591.391.1:591.158.1
Работа поддержана Программой Президиума Российской академии наук, номер проекта IV.13.3.
ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ in vitro МЕТОДОМ МЕЖВИДОВОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК КОРОВ (Bos taurus)
СЕМЕНЕМ ЗУБРА (Bison bonasus)
Г.Н. СИНГИНА, В.А. БАГИРОВ, С.С. ДАНЧ, T.E. ТАРАДАЙНИК,
А.В. ДОЦЕВ,
Н.А. ЗИНОВЬЕВА
Малочисленный вид европейский бизон (Bison bonasus), или зубр, находится под угрозой исчезновения. Технология получения эмбрионов in vitro с использованием яйцеклеток коров и семени зубра может стать эффективным инструментом сохранения генетических ресурсов вида и их рационального использования в фундаментальных исследованиях по физиологии развития и для создания новых селекционных форм животных. Однако методы получения эмбрионов in vitro с участием вышеуказанных половых клеток в литературе не описаны. В настоящей работе впервые была предпринята попытка оплодотворения яйцеклеток коров спермой зубра и оценка их дальнейшего эмбрионального развития in vitro с использованием протокола IVM (in vitro maturation, созревание in vitro)/IVF (in vitro fertilization, оплодотворение in vitro)/IVC (in vitro culture, культивирование in vitro), применяемого для получения эмбрионов крупного рогатого скота (Bos taurus). Источником половых клеток самок служили яичники коров, отобранные после убоя. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли методом рассечения видимых фолликулов. ОКК культивировали группами по 25-35 ооцитов в 500 мкл модифицированной среды ТС-199 под слоем легкого минерального масла («Sigma», США) в течение 24 ч. Созревшие яйцеклетки переносили в среду оплодотворения. Замороженную эпидидимальную сперму зубра размораживали и обрабатывали методом «swim-up». Созревшие ооциты коров культивировали совместно cо сперматозоидами в среде Fert-TALP в течение 18 ч, после чего их переносили в эмбриональную среду и культивировали до стадии бластоцисты. В качестве контроля часть яйцеклеток коров культивировали с эякулированным семенем быка. Результативность оплодотворения спермой обоих видов оценивали по характеру взаимодействия между исходными половыми клетками, а также по компетенции оплодотворенных яйцеклеток к раннему эмбриональному развитию. Доля ооцитов с признаками полиспермии была выше после оплодотворения спермой зубра, чем после оплодотворения бычьем семенем: соответственно 21,6 и 8,5 % (P < 0,05). При этом мы не выявили различий между двумя видами спермы в доле яйцеклеток с признаками проникновения сперматозоидов через зону пеллюцида (90,0±0,3 и 93,3±1,7 % соответственно для спермы быка и зубра), а также в доле нормально оплодотворенных ооцитов (78,3±1,7 и 73,2±2,3 %). Кроме того, в обоих случаях сходными были доля раздробившихся ооцитов и выход бластоцист. Представленные данные свидетельствуют о сходстве механизмов активации ооцитов и их эмбрионального развития у коровы и самок зубра. Также очевидно, что протокол IVM/IVF/IVC для крупного рогатого скота в целом позволяет получать in vitro гибридные эмбрионы коровы и зубра, но высокая степень полиспермии, наблюдаемая при гетерогенном оплодотворении, указывает на необходимость его корректировки.
Ключевые слова: ооциты коров, сперма Европейского бизона, оплодотворение in vitro, гибридные эмбрионы.
IN VITRO PRODUCTION OF INTERSPECIES HYBRID EMBRYOS OF CATTLE (Bos taurus) AND WISENT (Bison bonasus)
G.N. Singina, V.A. Bagirov, S.S. Danch, T.E. Taradainik, A.V. Dotsev,
N.A. Zinovieva
European bison or wisent (Bison bonasus)is a rare species that is endangered. The technology for producing in vitro embryos using oocytes of cows and wisent semen can be an effective tool for conservation of genetic resources of this species and their rational use in basic research on the physiology of development and to create the new animals’ types. However, the methods for production of in vitro embryos using the above-mentioned germ cells are currently not described in the literature. In this work, we first attempted to obtain the hybrid cow-wisent embryos in vitro using the IVM/IVF/IVC protocol, developed for domestic cattle (Bos taurus). Frozen epididymal sperm derived from wisent was thawed and prepared by the swim-up procedure. Matured oocytes were co-incubated during 18 h together with prepared sperm in Fert-Talp medium, which was replaced then by embrional medium where the embryos were cultured until the blastocyst state. Additionally, for positive control, a part of matured bovine oocytes were fertilized with frozen/thawed ejaculated bull sperm. Fertilizing capacity of male cells of both species was assessed according to the nature of spermatozoa-egg interactions, as well as the capacity of fertilized bovine oocytes to subsequent embryonic development. It was found that the rate of oocytes with sing polyspermy was higher for fertilization with wisent sperm comparing to allogenic insemination (21.6 vs. 8.5 %, P < 0.05). There were no differences between two types of fertilizations nether for the sperm penetration rate (90.0±0.3 vs. 93.3±1.7 % for bull and wisent, respectively), nor for the rate of normal fertilization (78.3±1.7 % vs. 73.2±2.3 %). The similar cleavage and blastocyst formation rates were observed for two fertilization types. Our data indicate the similarity in the mechanisms of oocyte activation and embryonic development in cow and wisent females. In addition, it is obvious that IVM/IVF/IVP protocol, in general, allows in vitroproducing cattle-wisent hybrid embryos, however, high levels of polyspermy observed in heterogeneous fertilization, indicates the necessity to adjust the method.
Keywords: cattle oocytes, the European bison sperm, fertilization in vitro, hybrid embryos.
ФГБНУ Всероссийский НИИ животноводства |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
