doi:10.15389/agrobiology.2016.6.837rus
УДК 636.4:619:616.636:578:[577.2.08+51-76
Работа выполнена в рамках проекта Российского научного фонда
«Создание кандидатной вакцины портив африканской чумы свиней
на основе химерных вирусов» № 16-16-00090.
ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ
ФРАГМЕНТЫ ПРОТЕКТИВНО ЗНАЧИМЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ
А.Р. ИМАТДИНОВ, А.Д. СЕРЕДА, И.Р. ИМАТДИНОВ,
А.С. КАЗАКОВА,
О.А. ДУБРОВСКАЯ, Д.В. КОЛБАСОВ
Контроль за африканской чумой свиней (АЧС) осложняется отсутствием средств специфической профилактики. Попытки получить живые вакцины традиционными методами оказались малоперспективными, а инактивированные и субъединичные — неудачными (N. Petuska, 1965; Д.В. Колбасов с соавт., 2014; V. Makarov с соавт., 2016). Исследования формирования протективного иммунитета при АЧС позволили определить решающую роль клеточных механизмов защиты и наиболее значимые участвующие в этом вирусные белки: р30, р54, CD2v (или ГП110-140) (P. Gomez-Puertas с соавт., 1998; J.M. Argilaguet с соавт., 2012; А.Д. Середа с соавт., 2015). В представляемой работе впервые созданы гибридные плазмиды, пригодные для протеомных исследований и разработки ДНК-вакцины против вируса АЧС III сероиммунотипа. Исследование выполнено с целью получения ДНК-конструкций, содержащих фрагменты генов CP204L, E183L, EP402R вируса АЧСаттенуированного штамма МК-200, и идентификации в трансфицированных ими эукариотических клетках соответствующих антигенно активных продуктов трансляции рекомбинантных белков rp30, rp54, rCD2v. Рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v трансфицировали культуру человеческих эмбриональных клеток почек, трансформированных геном Т-антигена вируса SV40 (HEK293T). Методом иммуноблоттинга в лизатах трансфицированных клеток определены и охарактеризованы по молекулярной массе экспрессированные рекомбинантные полипептиды. Среди полученных антигенно активных полипептидов одни по размеру соответствовали теоретически рассчитанным, другие — продуктам посттрансляционной модификации рекомбинантных белков. В лизатах клеток HEK293T, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, выявлен полипептид с молекулярной массой 21,6 кДа, в содержащих pCI-neo/ASFV/p54 — мажорный полипептид 20,9 кДа и минорный 36,3 кДа, в клетках с pCI-neo/ASFV/CD2v — мажорные полипептиды с молекулярной массой 39,8 и 63,1 кДа, а также минорные 28,8 и 104,7 кДа. Полученные модели позволят исследовать иммуногенные и протективные свойства созданных ДНК-конструкций.
A.R. Imatdinov, A.D. Sereda, I.R. Imatdinov, A.S. Kazakova,
O.A. Dubrovskaya,
D.V. Kolbasov
Control of African swine fever (ASF) is complicated by the lack of specific prevention medications. The attempts to obtain live attenuated vaccines by conventional methods were not promising, and the inactivated or subunit vaccines have not been developed so far (N.J. Petiska, 1965; D.V. Kolbasov et al., 2014; V. Makarov et al., 2016). The investigation of protective immune response against ASF virus (ASFV) enabled determination of a critical role of cellular defense mechanisms and the most important viral proteins p30, p54 and CD2v (or gp 110-140) involved (P. Gomez-Puertas еt al., 1998; J.M. Argilaguet et al., 2012; A.D. Sereda et al., 2015). In view to develop a DNA vaccine against ASFV seroimmunotype 3 we have constructed a set of hybrid plasmids containing fragments of ASFV genes CP204L, E183L and EP402R from attenuated strain MK-200 (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v). To study expression of the antigenically active polypeptide products for recombinant proteins rp30, rp54 and rCD2v in the eukaryotic cells, we transfected human embryonic kidney cells HEK293T, which stably express the SV40 large T antigen, with recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v. By immunoblotting, the polypeptides of the expressed recombinant proteins were identified in the HEK293T cell lysates and characterized for their molecular weights. Regarding size, some antigenically active recombinant polypeptides were as calculated, whereas the other ones apparently resulted from post translational modification. We identified a 21.6 kDa polypeptide after pCI-neo/ASFV/p30 transfection, a major (20.9 kDa) and a minor (36.3 kDa) polypeptides after pCI-neo/ASFV/p54 transfection, and, finally, major polypeptides of 39.8 kDa and 63.1 kDa, together with minor polypeptides of 28.8 kDa and 104.7 kDa when pCI-neo/ASFV/CD2v transfected. These genetic constructions will be helpful to investigate antigenic, immunogenic and protective properties of ASFV recombinant proteins rp30, rp54 and rCD2v.
Keywords: African swine fever, recombinant genes and proteins, transfection, antigenicity.
ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
