doi: 10.15389/agrobiology.2020.5.1040rus
УДК 582.98:581.43:57.086:577.21
В работе использовано оборудование ЦКП «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург) и ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ВНИИСХМ (г. Санкт-Петербург—Пушкин). Исследования проведены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00089). Локализация экспрессии генов LBD выполнена в рамках гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 19-04-01079-а).
ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ РЕПОРТЕРНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РАЗВИТИЯ КОРНЕВЫХ СИСТЕМ НА ПРИМЕРЕ ТЫКВЕННЫХ (Cucurbitaceae)
Е.Л. ИЛЬИНА, А.С. КИРЮШКИН, К.Н. ДЕМЧЕНКО ✉
Современные исследования тонких процессов развития растений невозможно представить без использования широкого спектра флуоресцентных белков (R. Day и M. Davidson, 2009; D. Chudakov с соавт., 2010), применение которых, однако, ограничено из-за несовершенства приемов их визуализации в растительных тканях. Растения представляют собой сложные объекты для микроскопических исследований: даже применение наиболее совершенных методов имеет значительное ограничение по глубине проникновения света по причине его рассеивания и поглощения клеточными стенками. Соответственно, для изучения распределения репортерных флуоресцентных белков в крупных органах, типичных для большинства растений, необходима фиксация растительного материала и приготовление толстых гистологических срезов с помощью микротома с вибрирующим лезвием. Химические вещества, традиционно используемые для фиксации, обезвоживания и заключения растительных образцов в заливочную среду приводят к изменению структуры флуоресцентных белков и, как следствие, к потере флуоресценции. Поэтому сохраняется актуальность оптимизации протоколов фиксации тканей растений, приготовления срезов, а также изучения распределения флуоресцентных белков при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. В представленной работе нами впервые предложен комплексный подход к фиксации тканей трансгенных растений и приготовлении срезов при изучении паттернов клеточного ответа на ауксин и экспрессии транскрипционных факторов с применением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Нашей целью было обобщение современных подходов в использовании эффективной универсальной методики визуализации тканевого и клеточного паттернов распределения флуоресцентных репортерных белков на срезах крупных органов немодельных растений. Первый шаг для использования флуоресцентных белков в растениях — создание генетических конструкций, несущих гены интереса и гены репортерных флуоресцентных белков. При этом необходимо наличие оптимальной методики трансформации для выбранного вида растений. В работе описано применение технологии клонирования Gateway® для получения векторов для трансформации растений, отвечающих современным экспериментальным задачам. Для изучения локализации ауксина in vivo мы получили серию векторов с генами, кодирующими флуоресцентные белки (eGFP, tdTomato, mRuby3), под контролем ауксин-чувствительного промотора DR5 (E. Ilina с соавт., 2012). Продемонстрировано преимущество использования ярких флуоресцентных белков с ядерной локализацией (mNeonGreen-H2B, tdTomato-H2B, mRuby3-H2B), а также возможность их применения для дополнительной визуализации ядер клеток в сочетании с высокоспецифичным окрашиванием клеточных стенок красителем SCRI Renaissance2200. Представлена методика конструирования векторов для изучения тканевого паттерна экспрессии генов регуляторов развития на примере ранее идентифицированных нами генов транскрипционных факторов GATA24 (А. Kiryushkin с соавт., 2019) и LBD16 у представителей семейства Cucurbitaceae (Тыквенные). На примере кассеты pAtUBQ10::DsRED1 (E. Limpens с соавт., 2004), несущей ген красного флуоресцентного белка под управлением конститутивного промотора, продемонстрирована высокая эффективность использования флуоресцентных белков для скрининга трансгенных органов растений. Представлена новая методика фиксации и просветления растительных тканей, содержащих репортерные флуоресцентные белки, и приготовления срезов на примере трансгенных корней у тыквенных. Показано преимущество использования расплавленной агарозы для ориентации растительных объектов при пробоподготовке по сравнению с заливочными средами. Также показано значение модифицированной нами заключающей просветляющей среды ClearSee (D. Kurihara с соавт., 2015) для повышения фотостабильности флуоресцентного белка на срезах. Таким образом, продемонстрированы преимущества, которые предоставляет применение комплекса современных методических подходов пробоподготовки и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для изучения биологии развития крупных немодельных растений.
Ключевые слова: агробактериальная трансформация, флуоресцентные белки, конфокальная микроскопия, развитие растений, транскрипционные факторы.
E.L. Ilina, A.S. Kiryushkin, K.N. Demchenko ✉
Modern studies of detailed processes in plant development would not be possible without using a wide range of fluorescent proteins (R. Day and M. Davidson, 2009; D. Chudakov et al., 2010). However, applications of fluorescent proteins are restricted due to problems with their visualization in plant tissues. Plants are difficult objects for microscopic studies. Indeed, even the most advanced methods have significant limitations regarding the depth of light penetration due to the scattering and absorption of light by cell walls. Therefore, to study the distribution of reporter fluorescent proteins in large organs typical for most plants, it is necessary to fix the plant material and prepare thick histological sections with a vibrating-blade microtome. Chemicals traditionally used for fixing, dehydrating, and embedding of plant tissues samples lead to changes in the structure of fluorescent proteins and, as a result, often to the loss of their fluorescence. Therefore, it is important to optimize the protocols for fixing plant tissues, preparing sections, and studying the distribution of fluorescent proteins by laser scanning confocal microscopy. In this work, we propose a novel, integrated, and potentially universal approach to fixation of tissues of transgenic plants and preparation of sections in the course of studying the patterns of cellular response to auxin and expression of transcription factors using laser scanning confocal microscopy. Our aim was to sum up modern approaches to the application of this technique for visualization of tissue and cellular patterns of fluorescent reporter proteins distribution on sections of large non-model plants. The first step for using fluorescent proteins in plants is the generation of genetic constructs that carry the promoter of the gene of interest fused to a reporter gene encoding a fluorescent protein. For this, a transformation protocol has to be available for the selected plant species. We have described the use of Gateway® cloning technology for the construction of vectors for plant transformation that meet modern experimental requirements. To study auxin localization in vivo we developed a series of vectors with genes encoding various fluorescent proteins (eGFP, tdTomato, mRuby3) under the control of the auxin-sensitive DR5 promoter (E. Ilina et al., 2012). We now demonstrate the advantage of nuclear-targeted fluorescent proteins (mNeonGreen-H2B, tdTomato-H2B, mRuby3-H2B), as well as the possibility of their application for additional visualization of cell nuclei in combination with highly specific cell wall staining using SCRI Renaissance2200. An effective method is presented for constructing vectors to study cell-specific expression patterns of developmental regulators using the transcription factor genes GATA24 (A. Kiryushkin et al., 2019) and LBD16 in some Cucurbitaceae species as examples. We also applied an expression cassette, pAtUBQ10::DsRED1 (E. Limpens et al., 2004), carrying a gene encoding red fluorescent protein under the control of a constitutive promoter, to demonstrate the advantages of the use of fluorescent proteins in screening for transgenic vs. wild type roots. A new method of fixation and clearing of plant tissues containing reporter fluorescent proteins and preparation of sections is presented, using transgenic roots of Cucurbitaceae as an example. The advantage of using melted agarose compared to embedding media for orienting plant parts during the preparation of samples is revealed. The increased photostability of fluorescent proteins in sections due to the use of clearing reagent ClearSee (D. Kurihara et al., 2015) as a mounting medium is demonstrated. In sum, we apply a complex of several modern methodological approaches of sample preparation and laser scanning confocal microscopy that offers significant advantages for studying the developmental biology of large non-model plants.
Keywords: agrobacterial transformation, fluorescent proteins, confocal microscopy, plant development, transcription factors.
ФГБУН Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, |
Поступила в редакцию |
