doi: 10.15389/agrobiology.2023.4.669rus
УДК 636.5.033:591.1:571.27
Исследования проведены при финансовой поддержке Российского научного фонда по проекту 22-16-00024.
БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНИТЕТА У ПЕТУШКОВ (Gallus gallus domesticus) РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ
Н.В. БОГОЛЮБОВА ✉, Р.В. НЕКРАСОВ, Д.А. НИКАНОВА,
А.А. ЗЕЛЕНЧЕНКОВА, Н.С. КОЛЕСНИК, Р.А. РЫКОВ, Н.А. ВОЛКОВА,
А.Н. ВЕТОХ, Л.А. ИЛЬИНА
Сравнительное изучение взаимосвязи процессов антиоксидантной защиты (АОЗ) и иммунитета в организме сельскохозяйственной птицы различных генотипов актуально при клинико-физиологической оценке состояния здоровья и поиске сочетаний генотипов для получения новых кроссов. В настоящей работе впервые установлены различия в биохимических и молекулярно-генетических индикаторах антиоксидантной защиты и иммунитета у петушков (Gallus gallus domesticus) пород русская белая, кросса Ross 308 и помесей пород русская белая и корниш. Описаны корреляции между экспрессией некоторых генов ферментов АОЗ и иммунитета в слепых отростках кишечника, тканях печени и среднесуточным приростом живой массы, а также между относительной экспрессией разных генов петушков. Целью работы было изучение факторов формирования иммунитета и антиоксидантного статуса, показателей неспецифического иммунитета, экспрессии генов ферментов, участвующих в антиоксидантной защите и развитии иммунного ответа, у петушков (Gallus gallus domesticus) разных генотипов.Исследования проводили в условиях физиологического двора ФИЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста в 2022 году. Образцы крови отбирали при убое в возрасте 9 нед у петушков русской белой породы (RW, n = 28), бройлеров кросса Ross 308 (n = 9) и помесей пород русская белая и корниш (CORN × RW, n = 128). Определяли концентрацию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП), с использованием наборов «Агат-Мед» (Россия), активность церулоплазмина (ЦП) по методу Ревина, суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов (СКВА) — амперометрическим методом на приборе ЦветЯуза-01-АА с амперометрическим детектором («Химавтоматика», Россия), соотношение ТБК-АП к ЦП — расчетным методом. СКВА оценивали эквивалентно галловой кислоте. Для этого из раствора галловой кислоты (100 мг/дм3) готовили рабочие растворы для градуировки с массовой концентрацией 0,2; 0,5; 1,0 и 4,0 мг/дм3. Элюентом служил раствор ортофосфорной кислоты (0,0022 моль/дм3). Остальные показатели антиоксидантного статуса — содержание глутатиона восстановленного (E-BC-K096-M), активность супероксиддисмутазы (СОД) (E-BC-K020-M), каталазы (E-BC-K031-M) и общий антиоксидантный статус (ОАС) (E-BC-K219-M) — определяли ИФА-методом с использованием микропланшетного фотометра Immunochem-2100 («High Technology, Inc.», США) и коммерческих наборов («Elabscience Biotechnology, Inc.», Китай) согласно протоколам, предложенным производителем. Показатели неспецифического иммунитета петушков RW (n = 12), CORN × RW (n = 68) и Ross 308 (n = 9) — бактерицидную (БАСК) и лизоцимную активность (ЛАСК) определяли с использованием микробиологического анализатора Multiskan FC («ThermoFisher Scientific, Inc.», Финляндия). Анализ относительной экспрессии генов проводили при помощи ПЦР в реальном времени. Для этого у петушков RW (n = 10), Ross 308 (n = 9) и CORN × RW (n = 11) отбирали образцы тканей слепых отростков кишечника и печени (всего 30 образцов каждой ткани). Определяли относительную экспрессию генов, отвечающих за антиоксидантную защиту (каталазы — CAT,глутатионпероксидазы — GSH-Gpx, гемоксигеназы 1 — HO-1, супероксиддисмутазы — SOD, родственного фактора транскрипции 2 NF-E2 — Nrf2) иучаствующих в развитии иммунного ответа (птичий бета-дефензин 9 — AvBD9, интерлейкин 6 — IL6, интерлейкин 8 — IL8). ОАС у бройлеров был ниже, чем у аналогов, что подтверждалось максимальным содержанием ТБК-АП — 4,27 против 3,04 мкмоль/л у RW (р < 0,05) и 2,79 мкмоль/л (р < 0,01) у CORN × RW, минимальным содержанием церулоплазмина (37,78 мг/л) и, соответственно, более высоким соотношением ТБК-АП/ЦП. При этом в крови петушков кросса Ross 308 наблюдалось максимальное СКВА (49,78 мг/л при р < 0,001 по сравнению с RW), что было обусловлено наибольшим среди аналогов количеством восстановленного глутатиона (38,26 мкмоль/л при р < 0,001 по сравнению с RW и р < 0,001 по сравнению с CORN × RW). Несмотря на это, а также на высокую активность каталазы в крови бройлеров (100,50 Ед/л при р < 0,05 по сравнению с RW и р < 0,01 по сравнению с CORN × RW), от их антиоксидантной системы требовалось наибольшее напряжение для нейтрализации активных форм кислорода (АФК). Изучение относительной экспрессии генов АОЗ и иммунитета подтвердило полученные данные. Так, в слепых отростках кишечника бройлеров относительная экспрессия генов CAT и GSH-Gpx была в 5 раз выше по сравнению с группой RW (соответственно р = 0,0007 и р = 0,0008), HO-1 — в 2 раза (р =0 ,01), SOD — на 40 %. В печени бройлеров наблюдалось снижение относительной экспрессии генов SOD и GSH-Gpx в 5-6 раз по сравнению с RW (р = 0,005 для обоих генов), экспрессия САТ возросла на 27 %, НО-1 — в 42 раза (р = 0,001). У бройлеров наиболее высокими были показатели содержания и активности лизоцима в сыворотке крови (0,47 мкг/мл и 3,14 AU/TP, p < 0,001) при снижении процента лизиса (36,1 против 45,6-48,7 % у остальных петушков, p < 0,05) при минимальной среди аналогов БАСК. Подтверждением служит тот факт, что экспрессия провоспалительных цитокинов (в первую очередь IL-8), ингибирующих гуморальный иммунитет, в исследуемых тканях бройлеров была в целом ниже, а у петушков других генотипов повышалась. Это и могло стимулировать снижение гуморального ответа. Среднесуточный прирост живой массы птицы в очень высокой степени коррелировал с экспрессией в слепых отростках кишечника CAT (r = 0,998 при р = 0,03) и AvBD-9 (r = 0,999 при р = 0,016). В слепых отростках обнаружены корреляции высокой степени между экспрессией CAT и AvBD-9 (r = 0,999 при р = 0,014), IL6 и HO-1 (r = 0,999 при р = 0,1), что подтверждает связь между АОЗ и здоровьем птицы. У бройлеров кросса Ross 308 отмечалось более высокое накопление продуктов перекисного окисления липидов, что подчеркивает целесообразность снижения окислительного стресса за счет алиментарных факторов и создания дополнительной защиты для антиоксидантной системы птицы с целью повышения качества птицеводческой продукции.
Ключевые слова: антиоксидантный статус, иммунитет, куры, бройлеры, генотипы, экспрессия генов, CAT, GSH-Gpx, HO-1, SOD, Nrf2, AvBD9, IL6, IL8.
N.V. Bogolyubova ✉, R.V. Nekrasov, D.A. Nikanova,
A.A. Zelenchenkova, N.S. Kolesnik, R.A. Rykov, N.A. Volkova,
A.N. Vetokh, L.A. Ilina
A comparative study of the relationship between the antioxidant protection (AOP) and immunity in poultry of various genotypes is relevant for clinical and physiological assessment of health status and the search for combinations of genotypes to obtain new crosses. In this work, for the first time, differences in biochemical and molecular genetic indicators of antioxidant protection and immunity were established for the Russian White, Ross 308 cross, and Russian White × Cornish cockerels. Correlations were revealed between the expression of some genes for AOP and immunity enzymes in caecum and liver tissues, and the average daily weight gain. The aim of the work was to assess the factors of immunity and antioxidant status, nonspecific immunity indicators, and gene expression levels for enzymes involved in antioxidant protection and immune response in male chickens (Gallus gallus domesticus) of different genotypes. The studies were carried out in 2022 at physiological yard of the Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry. Blood samples were taken from Russian White cockerels (RW, n = 28), Ross 308 cross broilers (n = 9) and Russian White × Cornish cockerels (CORN × RW, n = 128) at slaughter at the age of 9 weeks. The TBA test with thiobarbituric acid to measure the TBA-active products (TBA-AP) was performed with Agat-Med kits (Russia). The activity of ceruloplasmin (CP) was determined by the Revin method, the amount of total water-soluble antioxidants (TAWSA) amperometrially (a TsvetYauza-01-AA with an amperometric detector, Khimavtomatika, Russia), the ratio of TBA-AP to the CP was calculated. TAWSA was evaluated as equivalents to gallic acid using calibration solutions with a mass concentration of 0.2, 0.5, 1.0 and 4.0 mg/dm3 prepared from 100 mg/dm3 gallic acid. A solution of orthophosphoric acid (0.0022 mol/dm3)was used as an eluent. Other indicators of antioxidant status were determined with commercial kits (Elabscience Elabscience Biotechnology, Inc., China). Reduced glutathione (E-BC-K096-M), superoxide dismutase (SOD) (E-BC-K020-M), catalase (E-BC-K031-M) and total antioxidant status (TAS) (E-BC-K219-M) were measured by ELISA test (an Immunochem-2100 microplate photometer, High Technology Inc., USA). Nonspecific immunity (i.e., bactericidal activity BA and lysozyme activity LA) of RW (n = 12), CORN × RW (n = 68) and Ross 308 (n = 9) male chicks were determined (a microbiological analyzer Multiskan FC, ThermoFisher Scientific Inc., Finland). Analysis of relative gene expression was performed using real-time PCR. Tissue samples of the caecum and liver were taken from RW (n = 10), Ross 308 (n = 9), and CORN × RW (n = 11) cockerels, 30 samples of each tissue. The relative expression of the genes responsible for antioxidant protection (catalase CAT, glutathione peroxidase GSH-Gpx, heme oxygenase 1 HO-1, superoxide dismutase SOD, related transcription factor 2, NF-E2 Nrf2) and involved in the immune response (avian beta defensin 9 AvBD9, interleukin 6 IL6, interleukin 8 IL8) was assessed. Total antioxidant status (TAS) of broilers was lower than that of analogues, which was confirmed by the maximum content of TBA-AP, 4.27 vs. 3.04 µmol/l for RW (p < 0.05) and 2.79 µmol/l (p < 0.01) for CORN × RW, with a minimum content of ceruloplasmin (37.78 mg/l), and, accordingly, a higher TBA-AP/CP ratio. In the blood of Ross 308 cross males, the maximum TAWSA was detected (49.78 mg/l at p < 0.001 compared to RW), which was due to the maximum amount of reduced glutathione among analogues (38.26 μmol/l at p < 0.001 compared to RW and p < 0.001 compared to CORN × RW). The blood activity of catalase in broilers was also high (100.50 U/l at p < 0.05 compared to RW and p < 0.01 compared to CORN × RW). However, their antioxidant system must work at the maximum to neutralization of reactive oxygen species (ROS). Our data on the expression of AOP and immunity genes confirmed these conclusions. In the caeca of broilers, the genes CAT and GSH-Gpx expression was 5 times higher compared to egg breed cockerels (p = 0.0007 and p = 0.0008, respectively), HO-1 2 times higher ( p = 0.01), SOD higher by 40 %. In the liver of broilers, there was a decrease in the genes SOD and GSH-Gpx expression by 5-6 times compared to RW (p = 0.005 for both genes), CAT expression increased by 27 %, and HO-1 by 42 times (p = 0.001). In broilers, the blood lysozyme concertation and activity were the highest (0.47 μg/ml and 3.14 AU/TP, p < 0.001) with a decrease in the percentage of lysis (36.1 vs. 45.6-48.7 % in other cockerels, p < 0.05) with the minimum BA among analogues. This is confirmed by the fact that the expression of pro-inflammatory cytokines (primarily IL-8) which inhibit humoral immunity was generally lower in the studied broiler tissues while it increased in males of other genotypes. This could lead to a decrease in the humoral response. The average daily weigh gain of poultry highly correlated with the CAT (r = 0.998 at p = 0.03) and AvBD-9 (r = 0.999 at p = 0.016) expression in the caecum. In the caecum, high correlations were found between the expression of CAT and AvBD-9 (r = 0.999 at p = 0.014), IL6 and HO-1 (r = 0.999 at p = 0.1), which confirms the relationship between AOP and bird health. Ross 308 cross broilers showed a higher accumulation of lipid peroxidation products. This highlights the feasibility of using nutritional factors to reduce oxidative stress and increase the antioxidant potential of the body to improve the quality of poultry products.
Keywords: antioxidant status, immunity, chickens, broilers, genotypes, gene expression, CAT, GSH-Gpx, HO-1, SOD, Nrf2, AvBD9, IL6, IL8.
ФГБНУ ФИЦ животноводства — |
Поступила в редакцию |
