doi: 10.15389/agrobiology.2023.4.660rus
УДК 636.1.082.4:577.1
При проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Коллекция генетических ресурсов» ФГБНУ ВНИИ коневодства. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 20-16-00101-П.
ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ СПЕРМОПЛАЗМЫ ЖЕРЕБЦОВ (Equus ferus caballus L.) РАЗНОГО ВОЗРАСТА
М.М. АТРОЩЕНКО1 ✉, М.Г. ЕНГАЛЫЧЕВА1, 2, А.М. ШИТИКОВА1, 2
Криоконсервация семени жеребцов — современный широко распространенный в коневодстве способ сохранения генетического материала животных. Однако замораживание и последующее оттаивание снижает репродуктивные характеристики сперматозоидов. Одним из факторов, обусловливающих повреждение половых клеток, становится окислительный стресс, в результате которого повреждаются макромолекулы, в том числе протеины. С возрастом степень окислительного стресса нарастает, количество поврежденных белков увеличивается. В настоящей работе впервые установлено статистически значимое повышение содержания продуктов карбонилирования белков у возрастных животных по сравнению с более молодыми (в основном за счет альдегидных производных нейтрального характера). Впервые изучен резервно-адаптацтационный потенциал (РАП) спермоплазмы жеребцов. Обнаружено, что способность противостоять окислительному стрессу у молодых жеребцов достоверно выше, чем у возрастных. Нашей целью стала оценка спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков, а также изучение резервно-адаптацтационного потенциала спермоплазмы у жеребцов разного возраста. Исследование проводили в 2020 году на 40 жеребцах (Equus ferus caballus L.) чистокровной арабской и советской тяжеловозной пород (АО «Терский племенной конный завод № 169», Ставропольский край; Перевозский и Починковский конные заводы, Нижегородская обл.). От каждого жеребца получили по 3 эякулята с интервалом 48 ч. В I группу включили 20 жеребцов в возрасте от 14 лет до 21 года (средний возраст 15,8±1,9 года), во II группу — 20 жеребцов в возрасте от 3 до 5 лет (4,3±0,6 года). В каждом эякуляте определяли объем и концентрацию сперматозоидов в 1 мл спермы. Затем эякулят делили на две части, одну разбавляли лактозо-хелато-цитратно-желточной (ЛХЦЖ) средой в соотношении 1:3 и определяли прогрессивную подвижность (ПП) и выживаемость сперматозоидов при 4 °С. Для оценки выживаемости сперматозоидов при гипотермическом хранении спермы определяли их ПП с интервалом 24 ч вплоть до снижения ПП до 5 %. Сперму замораживали в парах жидкого азота в алюминиевых тубах объемом 18 мл по стандартной технологии ВНИИ коневодства и хранили в жидком азоте при -196 °С. Криоконсервированную сперму оттаивали на водяной бане при 40 °С в течении 90 с, после чего определяли ПП и выживаемость сперматозоидов при 4 °С. Другую часть эякулята центрифугировали при 3500 об/мин в течение 20 мин. После микроскопии супернатанта аликвоты семенной плазмы, свободные от сперматозоидов, замораживали в пробирках типа Эппендорф (2,0 мл) при -18 °С. Для количественной оценки окислительной модификации белков (ОМБ) использовали спектрофотометрический анализ 2,4-динитрофенилгидразонов, образовавшихся при взаимодействии карбонильных производных белков (альдегидов и кетонов) с 2,4-динитрофенилгидразином. Суммарное количество карбонильных производных регистрировали в нативной пробе биологического материала (спонтанная ОМБ) и после in vitro индукции окисления белков биологического материала реакционной смесью, содержащей растворы сульфата железа(II) и перекиси водорода (металл-катализируемая индуцированная ОМБ). Сравнение металл-катализируемой и спонтанной ОМБ позволяло оценить РАП — способность противостоять окислительному стрессу. Спектрофотометрические измерения проводили на 14 длинах волн: для регистрации альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера — в диапазоне 260-280 нм, основного характера — 258-264 и 428-520 нм, кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера — 363-370 нм, основного характера — 430-434 и 524-535 нм. Статистически значимые различия по показателям качества спермы между животными двух возрастных групп установили только по выживаемости сперматозоидов при гипотермическом хранении разбавленной (р < 0,05) и криоконсервированной (р < 0,01) спермы. Суммарное количество продуктов спонтанной ОМБ спермоплазмы возрастных жеребцов оказалось статистически значимо выше, чем у молодых (в единицах оптической плотности Еоп соответственно 531,7 и 384,3 Еоп/г белка, р < 0,05). Кроме того, в I группе отмечено смещение спектра поглощения в сторону альдегидных производных нейтрального характера, содержание которых у животных II группы было достоверно ниже (367,6 и 255,8 Еоп/г белка, p < 0,05). Оценка металл-катализируемой (индуцированной) ОМБ также выявила более высокое суммарное количество карбонильных производных у возрастных жеребцов, но нарастание количества производных при воздействии окислительной смеси оказалось намного выше по отношению к изначальной спонтанной ОМБ в группе молодых жеребцов. РАП спермоплазмы молодых жеребцов существенно превышал таковой у возрастных животных (p < 0,05), что может положительно сказываться на репродуктивных характеристиках нативной и криоконсервированной спермы.
Ключевые слова: Equus ferus caballus, жеребцы, сперма, спермоплазма, криоконсервация, окислительный стресс, окислительная модификация белков.
M.M. Atroshchenko1 ✉, M.G. Engalycheva1, 2, A.M. Shitikova1, 2
Cryopreservation of stallion semen is a modern widespread method in horse breeding for preserving the genetic material of animals. Freezing and thawing reduces the reproductive characteristics of spermatozoa. Oxidative stress that causes damage to macromolecules is a factor contributing to damage to germ cells. With age, the oxidative stress and the amount of damaged proteins increase. In this work, for the first time, we quantified products of oxidative modification of proteins (OMP) in semen plasma in stallions of different ages. There is a significant increase in the content of protein carbonylation products in older animals compared to younger ones, mainly due to neutral aldehyde derivatives. This study is the first to assess the reserve-adaptive potential (RAP) of the seminal plasma of stallions. It was found that the ability to withstand oxidative stress in young stallions is significantly higher than in older stallions. The aim of this study was to assess the level of spontaneous OMP, induced OMP and the RAP values for stallion spermatozoa as influenced by the animal age. The study was carried out in 2020 on 40 purebred Arabian and Soviet draft stallions (Equus ferus caballus L.) (AO Tersk breeding stud No. 169, Stavropol Territory; Perevozsky and Pochinkovsky stud farms, Nizhny Novgorod Province). Three ejaculates of each stallion were collected with a 48-hour interval. The stallions of group I (n = 20) were from 14 to 21 years of age (mean age 15.8±1.9 years), of group II (n = 20) from 3 to 5 years of age (4.3±0.6 years). In each ejaculate, the volume and concentration of spermatozoa in 1 ml of semen was determined. Then the ejaculate was divided into two parts, one was diluted with lactose-chelate-citrate-yolk (LCCY) medium in a ratio of 1:3 and the progressive motility (PM) and survival of spermatozoa were determined at 4 °C. To assess the survival of spermatozoa during hypothermic storage of sperm, its PM was determined with a 24-hour interval up to a decrease in PM to 5 %. Sperm was frozen in liquid nitrogen vapor in 18 ml aluminum tubes according to the standard of the All-Russian Research Institute for Horse Breeding and stored in liquid nitrogen at -196 °C. The cryopreserved sperm was thawed in a water bath at 40 °C for 90 s, followed by the determination of the spermatozoa PM and survival at 4 °C. Another part of the ejaculate was centrifuged at 3500 rpm for 20 min. After microscopy of the supernatant, aliquots of seminal plasma free of spermatozoa were frozen in 2.0 ml Eppendorf tubes at -18 °C. To quantify the OMP, we used the spectrophotometric analysis of 2,4-dinitrophenylhydrazones formed by the interaction of protein carbonyl derivatives (aldehydes and ketones) with 2,4-dinitrophenylhydrazine. The total amount of carbonyl derivatives was recorded in a native sample of biological material (spontaneous OMP) and after in vitro induction of protein oxidation of biological material with a reaction mixture containing solutions of iron(II) sulfate and hydrogen peroxide (metal-catalyzed induced OMP). From metal-catalyzed and spontaneous OMP, RAP was evaluated to characterize the OS resistance. Spectrophotometric measurements were carried out at 14 wavelengths, at 260-280 nm for neutral aldehyde-dinitrophenylhydrazones, at 258-264 and 428-520 nm for basic aldehyde-dinitrophenylhydrazones, at 363-370 nm for neutral ketone-dinitrophenylhydrazones, and at 430-434 and 524-535 nm for basic ketone-dinitrophenylhydrazones. Statistically significant differences in sperm quality between animals of two age groups were found only in the survival rate of spermatozoa during hypothermic storage of diluted (p < 0.05) and cryopreserved (p < 0.01) sperm. The total amount of spontaneous OMP products in the seminal plasma of older stallions was statistically significantly higher than in young stallions (531.7 and 384.3 ODU/g protein, respectively, p < 0.05). In addition, in group I, there was a shift in the absorption spectrum towards neutral aldehyde derivatives the content of which in animals of group II was significantly lower (367.6 and 255.8 ODU/g protein, p < 0.05). The evaluation of metal-catalyzed (induced) OMP also revealed a higher total amount of carbonyl derivatives in older stallions, but its increase under the influence of an oxidizing mixture was much higher vs. the initial spontaneous OMP in young stallions. The RAP value for the seminal plasma of young stallions significantly exceeds that of mature stallions (p < 0.05), which can positively affect the reproductive characteristics of native and cryopreserved sperm.
Keywords: Equus ferus caballus, stallions, sperm, seminal plasma, cryopreservation, oxidative stress, protein oxidative modification.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ коневодства, |
Поступила в редакцию |
