doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.664rus
УДК 636.52.58:619:616-099:575
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 20-76-10003.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ИММУНИТЕТОМ,
В ТКАНЯХ СЛЕПЫХ ОТРОСТКОВ КИШЕЧНИКА И ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ (Gallus gallus L.)
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ Т-2 ТОКСИКОЗЕ
Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ1 ✉, А.А. ГРОЗИНА2, В.Г. ВЕРТИПРАХОВ2 ✉,
Л.А. ИЛЬИНА1, В.А. ФИЛИППОВА1, Г.Ю. ЛАПТЕВ1, Е.А. БРАЖНИК1,
К.А. КАЛИТКИНА1, Н.В. ТАРЛАВИН1, А.В. ДУБРОВИН1,
Н.И. НОВИКОВА1, Д.Г. ТЮРИНА1
Значительная часть кормов для сельскохозяйственной птицы загрязнена Т-2 токсином. У птиц иммунная система представляет собой одну из мишеней для этого микотоксина. Однако результаты изучения действия Т-2 токсина на изменение функциональной активности генов,связанных с иммунной системы, у птиц крайне ограничены. В представляемом исследовании мы впервые показали, что активация в тканях поджелудочной железы генов регуляторных молекул развития воспалительной реакции (IL6 и PTGS2), генов, связанных с клеточной гибелью (Casp6), а также генов антимикробных факторов (прежде всего AvBD10) может служить ранним прогностическим маркером Т-2 токсикоза у бройлеров. Цель работы заключалась в оценке влияния Т-2 токсина на экспрессию вовлеченных в реакции иммунной системы генов в тканях слепых отростков кишечника и поджелудочной железы. Из бройлеров кросса Смена 8 сформировали четыре группы: I — контрольная, птица получала рацион без добавления Т-2 токсина, II — получала рацион с добавлением Т-2 токсина в количестве 100 мкг/кг (1ПДК), III — 200 мкг/кг (2ПДК), III опытная – 400 мкг/кг (4ПДК) (виварий ФНЦ ВНИТИП РАН, 2020 год). Длительность эксперимента — с 30- до 50-суточного возраста птицы, основной рацион соответствовал требованиям по кормлению кросса с учетом возраста. Анализировали активность генов, ассоциированных с воспалительной реакцией, апоптозом, а также с антимикробной и антивирусной защитой, — интерлейкина 6 IL6, интерлейкина 8 IL8, интерферона 7 IRF7, простагландин-эндопероксид-синтазы 2 (циклооксигеназы) PTGS2, b-дефензина 9 AvBD9 (Gal9), b-дефензина 10 AvBD10 (Gal10) и каспазы 6 Casp6. Референсным служил ген белка бета-актина ACTB. Режим и условия ПЦР-амплификации соответствовали предложенным разработчиками праймеров. Относительный уровень экспрессии оценивали с использованием метода 2-∆∆Ct. Для сопоставления экспрессии генов и биохимических показателей крови применили метод анализа главных компонент (PCA). Полученные нами данные свидетельствуют о модуляции экспрессии генов, ассоциированных с иммунитетом, в изученных тканях под воздействием Т-2 токсина. При экспериментальном Т-2 токсикозе у бройлеров активировалась (р ≤ 0,05) экспрессия генов провоспалительного цитокина IL6 и гена PTGS2 циклооксигеназы, участвующей в регуляции воспаления. Это может иметь неблагоприятные последствия для здоровья и продуктивности птицы, поскольку гиперпродукция провоспалительных цитокинов вовлечена в патогенез ряда заболеваний. Усиление (до 41,7-кратного, р = 0,0005) экспрессии гена PTGS2 в поджелудочной железе по сравнению с контролем наблюдалось во всех опытных группах. Также во всех опытных группах в тканях слепых отростков кишечника экспрессия гена Casp6, ассоциированного с фактором апоптоза, снижалась (максимально в 12,5 раза, р = 0,02) по сравнению с контролем. В тканях поджелудочной железы наблюдалось, наоборот, резкое повышение экспрессии гена Casp6при увеличении концентрации Т-2 токсина в кормах (р ≤ 0,0008). Во II группе экспрессия повышалась в 22,4 раза (р = 0,0008), в III группе — в 715,8 раза (р = 0,0003), в IV — в 31288,3 раза (р = 0,0003) по сравнению с контролем. В тканях слепых отростков кишечника бройлеров из III и IV групп экспрессия генов AvBD9 и AvBD10 снижалась по сравнению с контролем в 2,1-5,3 раза (р ≤ 0,05). В тканях поджелудочной железы, напротив, экспрессия этих генов во всех опытных группах значительно активировалась по сравнению с контролем (р ≤ 0,04). AvBD9 и AvBD10 — это гены, ассоциированные у птиц с синтезом β-дефензинов, которые связаны с усилением бактериостатической активности в отношениимногих патогенов. В слепых отростках кишечника бройлеров из II группы происходило 3-кратное (р = 0,03) угнетение экспрессии гена IRF7 по сравнению с контролем. Это может иметь негативные последствия для организма, поскольку ген IRF7 связан с синтезом регуляторного фактора интерферона 7, участвующего в противовирусной защите. В целом ткани поджелудочной железы оказались намного более чувствительны к воздействию Т-2 токсина, так как экспрессия практически всех исследованных генов значительно усиливалась по сравнению с таковой в тканях слепых отростков кишечника. Обращает на себя внимание повышение частоты апоптоза, с которым тесно связана активация каспазы, в тканях поджелудочной железы. Эта разница в выраженности иммунного ответа может быть обусловлена функциональным отличием кишечника от поджелудочной железы. C применением метода главных компонент (PCA) было продемонстрировано, что уровень экспрессии генов PTGS2 в поджелудочной железе, IL6, PTGS2, IL8, IRF7, AvBD9, AvBD10 и Casp6 в слепых отростках кишечника бройлеров, а также содержание в крови общего белка, глюкозы, триглицеридов, активность щелочной фосфатазы и трипсина и соотношение активности этих ферментов находились в тесной взаимосвязи. Активация вовлеченных в развитие воспалительной реакции генов IL6 и PTGS2 в тканях поджелудочной железы, генов, связанных с клеточной гибелью, например Casp6, а также антимикробных факторов, прежде всего AvBD10, может служить ранним прогностическим маркером Т-2 токсикоза у бройлеров. Уровень экспрессии таких генов может быть количественным показателем дозы воздействия и потенциального эффекта Т-2 токсина, а также чувствительности бройлеров к этому токсиканту при мониторинге рисков Т-2 токсикоза.
Ключевые слова: Т-2 токсин, микотоксикоз, бройлеры, экспрессия генов, иммунитет, цитокины, интерферон, апоптоз, β-дефензины.
E.A. Yildirim1 ✉, A.A. Grozina2, V.G. Vertiprakhov2 ✉, L.A. Ilyina1,
V.A. Filippova1, G.Yu. Laptev1, E.A. Brazhnik1, K.A. Kalitkina1,
N.V. Tarlavin1, A.V. Dubrovin1, N.I. Novikova1, D.G. Tyurina1
A significant proportion of poultry feed is contaminated with T-2 toxin. The bird’s immune system is one of the targets of this xenobiotic. However, the results of studying the effect of T-2 toxin on the expression of immunity genes in birds are extremely limited. In the present study, we have shown that contamination of broiler feed with T-2 toxin affects the level of expression of genes associated with the functioning of the immune system in the cecum and pancreas. The aim of the work was to assess the effect of T-2 toxin on the level of expression of genes involved in the immune system responses in the tissues of the intestine and pancreas cecum in broilers. The feeding trials with T-2 toxin added to the feed were carried out on broilers of the Smena 8 cross from 30 to 50 days of age (the vivarium of the Federal Research Center VNITIP RAS, 2020). Broilers were assigned to four treatments. The control group I received a diet with no T-2 toxin added, group II received a diet added with 100 μg/kg T-2 toxin, group III with 200 μg/kg, and group IV with 400 μg/kg. Gene expression was analyzed by quantitative PCR with reverse transcription (RT-qPCR). A reverse transcription reaction was performed to generate cDNA on an RNA template using the iScript™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, USA). The following primer pairs were used: for Interleukin 6 (IL6) F — 5′-AGGACGAGATGTGCAAGAAGTTC-3′, R — 5′-TTG-GGCAGGTTGAGGTTGTT-3′; for Interleukin 8 (IL8) F — 5′-GGAAGAGAGGTGTGCTTGGA-3′, R — 5′-TAAC-ATGAGGCACCGA-TGTG-3′; for Interferon 7 (IRF7) F — 5′-ATCCCTTGGAAGCACAACGCC-3′, R — 5′-CTGA-GGCAACCGCGTAGACCTT-3′; for Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) F — 5′-TC-GAGATCACACTTGATTGACA-3′, R — 5′-TTTGTGCCTTGTGGGTCAG-3′; for avian beta-defensin 9 (AvBD9(Gal9)) F — 5′-AACACCGTCAGGCATCTTCACA-3′, R — 5′-CGTCTTCTTGGCTGTAAGCTGGA-3′, for avian beta-defensin 10 (AvBD10(Gal10)) F — 5′-GCTCTTCGCT-GTTCTCC-TCT-3′, R — 5′-CCAGAGATGGTGAAGGTG-3′; for Caspase 6 (Casp6) F — 5′-CAG-AGGAGACAAGTGCCAGA-3′, R — 5′-CCAGGAGCCGTTTACAGTTT-3′. The beta-actin protein gene was a reference control. Amplification reactions were performed using a SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, USA). The amplification mode and conditions corresponded to those proposed by the primer developers. The relative expression level was estimated by the 2-ΔΔCT method. Biochemical blood profiles of broilers were analyzed (a Sinnowa BS3000P semi-automatic biochemical analyzer, SINNOWA Medical Science & Technology Co., Ltd, China) with a set of veterinary diagnostic reagents (DIAKON-VET, Russia). Principal component analysis (PCA) was used to compare gene expression levels and blood biochemical parameters. The expression of genes associated with the inflammatory response, apoptosis, antimicrobial and antiviral protection was evaluated. Activation (p ≤ 0.05) of the expression of the pro-inflammatory genes IL6 and PTGS2 occurred in broilers fed T-2 toxin. This can adversely affect the health and productivity of the birds, since the overproduction of proinflammatory cytokines is involved in the pathogenesis of several diseases. An increase (up to 41.7-fold, p = 0.0005) in the PTGS2gene expression in the pancreas was characteristic of all groups fed T-2 toxin compared to the control. In the tissues of the intestinal cecum, there was a decrease (up to 12.5-fold, p = 0.02) in the expression level of the Casp6 gene of the apoptosis factor regardless of the T-2 toxin dosage. In the pancreas, there was a reverse tendency of a sharp increase in the Casp6 gene expression as the T-2 toxin concentration increased (p ≤ 0.0008). In group II, the expression increased 22.4 times (p = 0.0008), in group III 715.8 times (p = 0.0003), in group IV 31288.3 times (p = 0.0003) compared to the control. The expression of AvBD9 and AvBD10 genes of avian β-defensins which are associated with a higher bacteriostatic activity against many pathogens decreased 2.1 to 5.3 times (p ≤ 0.05) in the caecum of broilers fed 200 and 400 200 μg/kg T-2 toxin. In the pancreas, regardless of the T-2 toxin dosage, on the contrary, the expression of these genes significantly increased (p ≤ 0.04). In the caecum, 100 μg/kg T-2 toxin exposure inhibited the IRF7 gene expression 3-fold (p = 0.03) compared to the control. This can negative affect birds’ health, since the IRF7 gene of the interferon regulatory factor 7 participates in counteraction against many viruses. In general, the pancreas was found to be more sensitive to the effects of the T-2 toxin because the expression of almost all studied genes was significantly increased as compared to that in the cecum tissue. This difference in the immune response may be due to the functional divergence between the intestine and the pancreas. PCA method revealed a close relationship between the expression of the PTGS2 gene in the pancreas, the IL6, PTGS2, IL8, IRF7, AvBD9, AvBD10, and Casp6 genes in the cecum and the total blood protein, trypsin, glucose, alkaline phosphatase, triglycerides, and phosphatase/trypsin coefficient. Our findings indicate the effect of feed contamination with T-2 toxin on the immunological functions of the caecum and pancreas of broilers through modulation of the immunity genes expression. Quantitative PCR analysis of the expression of immunity genes can serve as an effective tool for the search for predictive markers of T-2 toxicosis of poultry to monitor the health status of livestock in poultry farms.
Keywords: T-2 toxin, mycotoxicosis, broilers, gene expression, bird immunity, cytokine, interferon, apoptosis, β-defensins.
1ООО «БИОТРОФ+», |
Поступила в редакцию |
