Сельскохозяйственная биология, 2014, № 4, с. 75-79.

УДК 636.4:619:578.835.2:636.085:577.2:57.083

doi: 10.15389/agrobiology.2014.4.75rus

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРОВ ПРИ ИНДИКАЦИИ ДНК ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В КОМБИКОРМЕ С ПОМОЩЬЮ ПЦР-РВ

Д.А. КУДРЯШОВ, С.А. КАТОРКИН, Е.В. АРОНОВА, О.Н. БУРДИНСКАЯ, Ю.П. МОРГУНОВ, И.Х. ГАЗАЕВ, С.Ж. ЦЫБАНОВ, Д.В. КОЛБАСОВ

Известно, что распространение вируса африканской чумы свиней (АЧС) происходит при алиментарной передаче возбудителя (например, вследствие использования контаминированных вирусом пищевых и боенских отходов, не подвергнутых термической обработке, комбикормов, не прошедший ветеринарно-санитарную экспертизу и поступающий из районов, неблагополучных по АЧС, в случаях, когда перевозка комбикорма осуществлялась в транспортных средствах, не подвергшихся ветеринарно-санитарной обработке). При анализе комбикормов с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одно из требований заключается в тщательной очистке образцов от крупных частиц и различных химических примесей, которые могут ингибировать реакцию, изменять свойства сорбента и мембранных фильтров на стадии выделения нуклеиновых кислот. Наша цель заключалась в разработке методики пробоподготовки с использованием мембранных фильтров для изучения возможности индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в искусственно контаминированном комбикорме с помощью ПЦР. Для контаминации использовали кровь от свиньи, экспериментально зараженной вирусом АЧС (штамм Ставрополь 2009) с инфекционным титром 5,0 lg ГАЕ₅₀/см³. Рабочие разведения вируссодержащего материала — 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 lg ГАЕ₅₀/см³. Подготовка проб включала фильтрование через марлю, замораживание-оттаивание, низкоскоростное центрифугирование и разделение на фильтрах с диаметром пор 450 мкм. Последующее выделение ДНК вируса АЧС и ПЦР-РВ выполняли согласно инструкции по применению соответствующей разработанной тест-системы. Установлено, что в подготовленных предложенным способом пробах искусственно контаминированного комбикорма ДНК вируса АЧС выявляется в материале с титром вируса не менее 3,0 lg ГАЕ₅₀/см³. Таким образом, включение в диагностическую схему рекомендуемой стадии подготовки проб, описанной выше, при анализе комбикорма позволяет получить очищенный от примесей и сконцентрированный материал, который может быть использован для дальнейших исследований на наличие ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ.

Ключевые слова: африканская чума свиней, АЧС, вирус африканской чумы свиней, комбикорм, пробоподготовка, мембранные фильтры, ПЦР в реальном времени, ПЦР-РВ.

Полный текст

ТHE USE OF MEMBRANE FILTERS IN DETECTION OF THE ASF VIRUS DNA IN THE FEED COMPOUND BY RT-PCR

For African swine fever (ASF) virus an alimentary transmission way is known to be characteristic. In particular, the infection occurs because of use of the contaminated domestic and slaughtering wastes or the feed compounds originated from epizootic region which have not been duly controlled, or in case the package used for feed transportation were not treated against African swine virus. Under feed compound analysis by real-time PCR (RT-PCR), the samples must be free from large particles and chemical substances which can inhibit the polymerase reaction and influence the sorbent and membrane properties during nucleic acid isolation. We aimed to improve the feed compound processing technique by using membrane filters to prepare the samples for further RT-PCR indication of ASF virus. In the experiments, the feed was artificially contaminated by blood of a swine previously infected by the ASF virus Stavropol 2009 strain, the titer of 5.0 lg HAD₅₀/cm³. Also the dilutions of 2.0, 3.0 and 4.0 HAD₅₀/cm³ were tested. During processing, the crud filtration, freezing-defrostation procedure, centrifugation and separation on membrane filters (450 mm) were applied. Then the ASF virus DNA isolation and PCR-RT were conducted using the developed test-system and procedure. It was found out that the ASF virus DNA can be detected by the proposed method in the feed compound when the titer of virus used for artificially contaminated is at least 3.0 lg HAD₅₀/cm³. So, the modifying procedure of fodder sample preparation described hereinabove is effective to obtain purified and concentrated material for further ASF virus DNA analysis.

Keywords: African swine fever, ASF, African swine fever virus, feed compound, sample preparation, membrane filters, RT-PCR.

Оформление электронного оттиска