УДК 636.086.2/.3:581.143.6:631.527.8
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ НЕФТИ ДЛЯ ПОЛЕВИЦЫ ПОБЕГОНОСНОЙ (Agrostis stolonifera L.) И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ
Е.В. ОРЛОВА1, Е.А. ГЛАДКОВ1, 2, О.В. ГЛАДКОВА2, А.Ю. СТЕПАНОВА1
При определении токсичности нефти для растений и каллусных культур полевицы побе-гоносной (Agrostis stolonifera L.) показано, что содержание нефти в почве 1 % приводило к за-держке роста, 5 % — к гибели растений. Токсичность нефти для каллусных культур была выше, чем для растений: при инкубации каллусов на питательной среде, содержащей 0,5 % нефти, спо-собность к росту сохранялась у 52 % клеток, при 0,8 % — у 25 %, при содержании нефти 1 % наблюдалась остановка роста и гибель каллусов. Для отбора устойчивых к нефти клеток каллус культивировали в течение двух пассажей на среде Мурасиге-Скуга с содержанием нефти 0,5 %, затем пересаживали на среду для регенерации с таким же количеством нефти. Всего в селективных условиях получено 19 растений.
Ключевые слова: Agrostis stolonifera, клеточная селекция, нефть.
Загрязнение почв нефтью и продуктами ее переработки в процессе нефтедобычи, аварийных разливов и при транспортировке может приводить к уменьшению продуктивности лесов и лугов, деградации сельскохозяйственных угодий, падению урожайности, представляет серьезную экологическую проблему. В критических ситуациях почвы могут превращаться в типичные техногенные пустыни, где практически полностью подавлена жизнедеятельность биотопа.
Нефть состоит из нескольких тысяч соединений, но основные ее компоненты (90-95 % объема) — углеводороды: алканы, циклоалканы, ароматические углеводороды, асфальтены и смолы, олефины. В ее состав также входит сера и различные микроэлементы. В связи со сложным составомнефтепродукты оказывают комплексное воздействие на растения: как прямое токсическое, так и опосредованное, связанное с преобразованием морфологических, физико-химических свойств и микробиологических характеристик почвы. Рост гидрофобности и другие изменения физических свойств почвы обусловлены тяжелыми, а прямой токсический эффект нефтезагрязнения — легкими фракциями углеводородов нефти (1-3). Фитотоксические свойства нефтезагрязненных почв проявляются в значительном снижении всхожести семян, ингибировании роста корней и проростков растений (4-7).
Фитотоксический эффект нефтезагрязнения показан для ряда культур, в том числе кормовых растений и трав — овса, ячменя, клевера, люпина, овсяницы, ежи (4). При низких дозах загрязнения через 2 мес ингибирующее действие нефти снижается практически до фонового уровня, вероятно, вследствие летучести легких фракций. При высокой степени загрязнения токсический эффект тяжелых фракций, связанный с деградацией почвы, сохраняется продолжительное время. В ряде случаев при сочетании, например, засоленности и нефтезагрязнения урожайность сохраняет только подсолнечник, тогда как большинство сельскохозяйственных злаковых, крестоцветных, сложноцветных и бобовых растений погибают (8).
При современном уровне развития нефтяного комплекса исключить воздействие нефти на окружающую среду невозможно, в связи с чем возникает необходимость получения растений, устойчивых к этому поллютанту. Такие растения могут использоваться на почвах, загрязненных нефтью, около нефтяных скважин, трубопроводов, хранилищ и нефтеперерабатывающих заводов, после первичной биоремедиации (с помощью микроорганизмов). Привлекательным приемом создания устойчивых культур представляется клеточная селекция, которая зарекомендовала себя как перспективный метод получения растений, устойчивых к другим абиотическим стрессам: засухе, засолению, затоплению, тяжелым металлам (9-14). Несмотря на большое числоработ, посвященных селекции культивируемых клеток, нам известна всего одна, в которой оценивалась токсичность углеводородов (гептана и гексана) в условиях in vitro, однако задача выделения устойчивых клеточных линий и растений при этом не ставилась (15).
Наша цель заключалась в подборе схемы клеточной селекции для получения растений-регенерантов и их проверке на устойчивость к нефтезагрязнениям.
Методика. В качестве объекта исследования использовали полевицу побегоносную (Agrostis stoloniferaL.). Каллус получали из семян, которые предварительно стерилизовали коммерческим отбеливателем «Белизна» в течение 30 мин, затем промывали 3 раза стерильной дистиллированной водой и помещали на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) (16), содержащую тиамин (1 мг/л), никотиновую кислоту (0,5 мг/л), пиридоксин (0,5 мг/л), мезо-инозит (100 мг/л), гидролизат казеина (500 мг/л), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) (4 мг/л), сахарозу (30 г/л) и агар-агар (7 г/л). В каждую чашку Петри помещали по 30 семян и культивировали при температуре 26 °С и влажности 70 % на свету (2000 лк, длина светового дня 16 ч). Через 30 сут образовавшийся каллус пересаживали на ту же среду, содержащую 1 мг/л 2,4-Д.
Для регенерации каллус помещали на среду МС без гормонов. Укоренение растений проводили на среде МС без гормонов с половиной дозы макро- и микросолей (от рекомендуемой по прописи) в течение 2-4 нед. Время культивирования определяли в зависимости от степени развития корневой системы. Укоренившиеся регенеранты перед высадкой в почву адаптировали в теплице (сначала 1 сут в открытых культуральных сосудах на агаре, а затем 3 сут на воде).
В экспериментах использовали смесь нижневартовской и грозненской нефти, имеющую следующие характеристики: удельная плотность — 0,83; суммарное содержание углеводородов — 81,2 %, в том числе n-алканов — 9,3 %, изоалканов — 7,9 %, нафтенов — 11,7 %, ароматических углеводородов — 64,0 %; содержание смол — 3,1 %, асфальтенов — 4,0 %. При определении токсичности нефти для растений в сосуды вносили почву (100 г), добавляли нефть, тщательно перемешивали и высаживали семена (по 20 шт., в каждом варианте использовали не менее 60 шт.). Контролем служили растения, выращенные на почве без нефти. Для оценки токсичности нефти в условиях in vitro семена полевицы помещали на агаризованную среду в чашки Петри с конечным содержанием нефти 0,5; 0,8; 1,0 и 5,0 %. Для равномерного распределения нефти агаризованную среду доводили до кипения, остужали до 40 °С, тщательно перемешивали с нефтью и разливали в чашки Петри. Контролем служили стерилизованные семена в тех же условиях, но без внесения нефти. Выживаемость оценивали после 7 и 14 сут культивирования.
Для определения чувствительности каллусной ткани ее помещали на агаризованную среду с разным содержанием нефти, добавленной, как описано выше. Выживаемость каллусов (доля выживших от общего числа, %) оценивали после 1 мес культивирования. Каллусы инкубировали в чашках Петри при 26 °С на свету (2000 лк, длина светового дня 16 ч).
Доверительный интервал рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента при 95 % уровне вероятности.
 |
Рис. 1. Всхожесть семян полевицы побегоносной Agrostis stolonifera L. при содержании нефти в почве 0,5 % (а), 0,8 % (б) и 1,0 % (в) (лабораторный опыт). |
Результаты. Так как нефть гидрофобна, ее использование в условиях in vitro представляет определенную трудность. В этой связи прежде всего необходимо было оценить возможность применения нефти в качестве селективного агента и определить чувствительность растений и каллусных культур полевицы побегоносной к указанному токсиканту. По данным литературы, фитотоксичность нефти зависит от состава, температурного режима и влажности почвы, от состава самой нефти и видовой принадлежности растения (1, 6, 17, 18). Например, для кукурузы токсическое действие нефти проявляется при ее содержании 1 %, для овсяницы и ежи — при 5 %, для клевера, люпина, овса, ячменя — 10 %; наибольшей устойчивостью к нефтяному загрязнению обладает подсолнечник (17 %) (4). Нижний предел безопасного содержания нефтепродуктов на территории России составляет 1000 мг/кг (0,1 %), верхний — колеблется от 0,1 (для мерзлотно-тундрово-таежных районов) до 1,0 % (для лесостепных и степных районов) (19). Надо отметить, что в районах, связанных с активной нефтедобычей, транспортировкой и использованием нефтепродуктов, количество загрязнителя часто превышает верхний безопасный предел. С учетом этого в наших экспериментах содержание нефти по вариантам составляло от 0,5 % до 5,0 %. Показано, что в варианте с 0,5 % всхожесть семян угнеталась значительно (в течение 1-й нед проросло только 55 % семян относительно контроля), при содержании 0,8 % проросло 33 % семян; в вариантах с 1,0 % и 5,0 % нефти семена не проросли. После 2 нед анализируемый показатель составил 80 % в варианте с 0,5 %, 65 % — в варианте с 0,8 % и 37 % — в варианте с 1,0 % нефти (рис. 1).
| 1. Выживаемость каллусов полевицы побегоносной Agrostisstolonifera L. после культивирования в течение 1 мес на агаризованной среде с разным содержанием нефти (лабораторный опыт) | |||
Содержание нефти, % |
Число каллусов, шт. |
Выживаемость, % |
|
общее |
выживших |
||
0 (контроль) |
100 |
100 |
100 |
0,5 |
200 |
103 |
52 |
0,8 |
200 |
50 |
25 |
1,0 |
200 |
0 |
0 |
5,0 |
50 |
0 |
0 |
Вероятнее всего, это связано с испарением легких фракций. Присутствие 5,0 % нефти в почве (содержание, которое по шкале загрязнения оценивается как «очень высокое») приводило к полной потере всхожести семян. В чашках Петри (в условиях in vitro) отмечалось снижение всхожести семян в 5-6 раз по сравнению с показателями при выращивании в почве. Кроме того, в условиях in vitro (в отличие от вариантов, когда использовалась почва) число проросших семян после 14 и 28 сут культивирования оставалось таким же, как на 7-е сут (возможно, система in vitro закрытая, что препятствует естественной деградации нефти). При содержании нефти 5,0 % так же, как и в опытах с почвой, семена не прорастали. Таким образом, условия in vitro оказались более жесткими, чем почвенные, что дает основания использовать систему in vitro для отбора устойчивых клеток. Учитывая приведенные выше данные, реакцию каллусных культур полевицы на нефть оценивали при ее содержании 0,5; 0,8 и 1,0 %.
| 2. Регенерационная способность каллусов полевицы побегоносной Agrostis stolonifera L. после культивирования в течение 1 мес на агаризованной питательной среде с разным содержанием нефти (лабораторный опыт) | ||
Содержание нефти, % |
Число, шт. |
|
каллусов общее |
регенерантов |
|
0 (контроль) |
100 |
90 |
0,5 |
100 |
23 |
0,8 |
100 |
10 |
1,0 |
100 |
0 |
5,0 |
100 |
0 |
При инкубации каллуса на среде с 0,5 % нефти способность к росту сохранилась у 52 % каллусов, с 0,8 % — у 25 % относительно контроля. Инкубация каллусов в течение 1 мес на среде, содержащей 1,0 и 5,0 % нефти, приводила к остановке их роста и гибели (табл. 1). Инкубация в селективных условиях вызывала также значительное снижение способности к морфогенезу. При 0,5 % нефти в среде только 23 % каллусов были способны к регенерации растений, при 0,8 % — 10 % (табл. 2).
 |
Рис. 2. Схема селекции устойчивых к нефтезагрязнению растений полевицы побегоносной Agrostis stolonifera L. с использованием каллусных культур. |
Более высокую чувствительность морфогенеза к стрессам (по сравнению с ростом) отмечали и другие авторы для сахарного тростника (11) и риса (20). Вероятно, процесс дифференцировки, связанный с активными клеточными делениями, требует больше энергии и поэтому сильнее лимитируется в условиях стресса. Поскольку основная задача клеточной селекции заключается в получении растений-регенерантов, в качестве селективных были выбраны варианты с содержанием нефти 0,5 и 0,8 %. Селекцию резистентных клеток проводили в два этапа. На первом каллус полевицы инкубировали на агаризованной питательной среде с 0,5 и 0,8 % нефти в течение 1 мес. Далее одну часть каллусов, отобран-ных со среды с содержанием нефти 0,5 %, пересаживали на среду с 0,8 % нефти, другую часть — на среду с 0,5 % нефти. Каллус, который инкубировали на среде с 0,8 % нефти, повторно высаживали в те же условия (рис. 2). Каллусы, постоянно выращиваемые на среде с 0,8 % нефти, через 2 мес культивирования погибли. Каллусы, которые культивировали в течение 1 мес на среде с 0,5 % нефти, а затем на среде с 0,8 % нефти, также погибли. При культивировании на среде с 0,5 % нефти в течение 2 мес из отобранных устойчивых каллусов удалось получить 19 растений-регенерантов, из которых три сформировали семена.
Всхожесть семян, полученных от прошедших селекцию растений, при высадке на среду, содержащую нефть (1,0 и 1,5 %, контроль — семена от растений, выращиваемых на почве без нефти), существенно не различалась по вариантам опыта и составила 70 %. У семян растений, не прошедших селекцию, этот показатель в варианте с 1,0 % нефти составлял 50 %, в варианте с 1,5 % — 40 %. При количестве нефти в почве 1,5 % выжившие отселектированные растения имели среднюю высоту стебля 5,0 см, неотселектированные — 2,5 см (средняя высота растений в соответствующих контрольных группах без токсиканта — 8,0 см). Однако через 1,5 мес растения, для выращивания которых использовалась почва, содержащая нефть, сравнялись по высоте с контролем (растения без токсиканта). Возможно, это связано с ослаблением токсического действия нефти и развитием в почве нефтеокисляющей микрофлоры. Однако всхожесть семян при этом не изменялась.
Таким образом, впервые проведена оценка токсичности нефти в условиях in vitro для каллусных культур полевицы побегоносной и разработаны условия для отбора устойчивых растений. Непродолжительность селекции была применена нами как методический прием, позволивший сохранить регенерационную способность клеток и значительно ускорить получение устойчивых растений.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. А р е н с В.Ж., С а у ш и н А.З., Г р и д и н О.М., Г р и д и н А.О. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений. М., 1999.
2. О б о р и н А.А., К а л а ч н и к о в а И.Г., М а с л и в е ц Т.А., Б а з е н к о в а Е.И., П л е щ е в а О.В., О г л о б л и н а А.И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М., 1988: 140-159.
3. З в я г и н ц е в Д.Г., Г у з е в B.C., Л е в и н С.В., С е л е ц к и й Г.И., О б о
р и н А.А. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью. Почвоведение, 1989, 1: 72-78.
4. Д е д к о в В.П., Ф о м и н ы х Я.В. Действие нефтяного загрязнения на рост и развитие растений. В межвуз. сб. науч. тр.: Теоретические и прикладные аспекты биологии Калининград, 1999: 36-42.
5. Д е д к о в В.П., Г р е б е н н и к о в А.С., Т у р к и н Н.И. Рост и развитие растений на почве, загрязненной нефтью. В межвуз. сб. науч. тр.: Теоретические и прикладные аспекты биологии. Калининград, 1997: 36-42.
6. A d a m G., D u n c a n H.J. Effect of diesel fuel on growth of selected plant species. Environ. Geochem. Health, 2000, 21: 353-357.
7. G a s k i n S., S o o l e K., B e n t h a m R. Screening of Australian native grasses for rhizoremediation of aliphatic hydrocarbon-contaminated soil. Int. J. Phytorem., 2008, 10: 378-389.
8. К и р е е в а Н.А., Б а к а е в а М.Д., Т а р а с е н к о Е.М. Комплексное биотестирование для оценки загрязнения почв нефтью. Экология и промышленность России, 2004, 2: 26-29.
9. P u r n h a u s e r L., G y u l a i G. Effect of copper on shoot and root regeneration in wheat, triticale, rape and tobacco tissue cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1993, 35: 131-139.
10. Д о л г и х Ю.И., Л а р и н а С.Н., Ш а м и н а З.Б., Ж д а н о в а Н.Е., П у с т о-
в о й т о в а Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий. Физиология растений, 1994, 41: 853-858.
11. Х а р и н а р а й н Р.П., Г у ж о в Ю.Л., Д о л г и х Ю.И. Перспективы использования биотехнологических методов в селекции сахарного тростника Saccharum officinarum на устойчивость к гипоксии. Изв. РАН (сер. биол.), 1996, 4: 411-421.
12. Г л а д к о в Е.А. Биотехнологические методы получения растений полевицы побегоносной Agrostisstolonifera, обладающих устойчивостью к кадмию и свинцу. С.-х. биол., 2008, 3: 83-87.
13. А л ь - Х о л а н и Х.А.М., Т о а й м а В.И.М., Д о л г и х Ю.И. Получение растений кукурузы с повышенной устойчивостью к засухе путем клеточной селекции на среде с маннитом. Биотехнология, 2010, 1: 60-67.
14. T e r e s h o n o k D.V., S t e p a n o v a A.Yu., D o l g i k h Yu.I, O s i p o v a E.S., B e
l y a e v D.V., V a r t a p e t i a n B.B. Tolerance to root flooding of wheat plants (Triticum aestivum L.) produced with biotechnological approaches. Plant Stress, 2010, 4(1): 79-82.
15. С е р г е е в а Л.Е. Определение токсичности парафинов в системе in vitro. Физиология и биохимия культурных растений, 2000, 32(4): 325-328.
16. M u r a s h i g e T., S k o o g F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497.
17. R o b s o n D., K n i g h t D., F a r r e l l R., G e r m i d a J. Ability of cold tolerant plants to grow in hydrocarbon-contaminated soil. Int. J. Phytorem.,2003, 5: 105-123.
18. F r i c k C.M., F a r r e l l R.E., G e r m i d a J.J. Assessment of phytoremediation as an in-situ technique for cleaning oil-contaminated sites. Calgary, Petroleum Technology Alliance of Canada, 1999.
19. Д а в ы д о в а С.Л., Т а г а с о в В.И. Нефть и нефтепродукты в окружающей среде. М., 2004.
20. Б е л я н с к а я С.Л., Ш а м и н а З.Б., К у ч е р е н к о Л.А.Морфогенез в клонах риса, резистентных к стрессовым факторам. Физиология растений, 1994, 41(4): 573-577.
E.V. Orlova1, E.A. Gladkov1, 2, O.V. Gladkova2, A.Yu. Stepanova1
The toxic influence of the crude oil on plants and callus of Agrostis stolonifera L. was investigated. It was shown that content 1.0 % crude oil in the soil led to inhibition of growth, 5.0 % — to the death of plants. The toxicity of crude oil to calluses was higher in comparison with plants. The growth inhibition was observed after incubation of the callus in Murashige-Skoog (MS) medium containing 0.5 % of crude oil: only 52 % of Agrostis stolonifera cells was retained growth activity, and with 0.8 % of crude oil — 25 %. The incubation with 1.0 % of crude oil resulted in the arrest of the growth and the death of calluses. For further selection of oil tolerant cells the callus was cultivated in the MS medium with 0.5 % of crude oil during two subculturings, then transplanted in the medium for regeneration with the same concentration of petroleum. In total in selective conditions 19 plants were received.
Keywords: Agrostis stolonifera, cell selection, oil.
| 1Учреждение Российской академии наук Институт
физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276 г. Moсква, ул. Ботаническая, 35, e-mail: gsc@ippras.ru; 2ФГОУ ВПО Московский государственный |
Поступилавредакцию |
Оформление электронного оттиска
