Сельскохозяйственная биология, 2009, № 4, с. 46-50.

УДК 636.52/.58:612.35

О РОЛИ МИТОХОНДРИЙ В СТАНОВЛЕНИИ ВИТЕЛЛОГЕННОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ У КУР

Л.Г. КОРШУНОВА

На цыплятах породы белый леггорн в научном опыте изучали динамику влияния эстрогенизации на массу печени, активность синтеза мтДНК и мтРНК, окислительное фосфорилирование. Показано, что однократное введение цыплятам 17-β-эстрадиола в дозе 30 мг/кг живой массы индуцировало вителлогенную функцию печени, интегрированную с био-генезом, функциональной специализацией митохондрий, показателями окислительного фосфорилирования.

Ключевые слова: митохондрии, печень, кровь, курица, эстрадиол, вителлогенез.

С наступлением яйцекладки в печени кур, играющей доминирующую роль в липидном обмене, значительно усиливается функциональная активность, в частности начинается синтез белковых и липидных компонентов желтка, которые поступают в кровь и затем поглощаются желточными фолликулами (1). Регуляция этих процессов находится под контролем эстрогенов, следовательно, имеется возможность их моделирования введением эстрогенов цыплятам. Ввиду отсутствия у цыплят фолликулов белковые и липидные предшественники будут накапливаться в крови, и их концентрация позволит судить об изменении синтетической активности печени, связанной со становлением ее вителлогенной функции.

При снесении яйца с каждым желтком из организма курицы выделяется около 6 г липидов и 3 г белка. Такая активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондриальный аппарат печени, обеспечивающий производство необходимого количества макроэргических соединений для анаболических процессов в тканях и органах (2, 3).

Ранее было показано, что у кур регуляция энергетического обмена в митохондриях печени влияет на продуктивность (4), установлены изменения цитохромоксидазной и фосфорилирующей активности печени в зависимости от содержания витаминов в рационе, определены дозы витаминов, стимулирующие энергетический обмен (5).

Целью настоящей работы стало изучение взаимосвязи и соотношения между активностью процессов становления вителлогенной функции пе-чени и основными биоэнергетическими функциями митохондрий на модели индуцированного эстрогеном вителлогенеза у цыплят.

Методика. Исследования выполняли на птице породы белый леггорн: 3-месячных цыплятах (в этот период у них наблюдается координированное развитие репродуктивной системы), курах 8-месячного возраста (в период интенсивной яйцекладки, яичная продуктивность — 80 %) и петухах того же возраста. Было сформировано две группы цыплят по 50 гол. в каждой (контрольная и опытная), одна группа кур (5 гол.) и одна — петухов (5 гол.). Птица содержалась в условиях вивария ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП—РАСХН» (Московская обл.).

Индукцию вителлогенной функции печени у цыплят опытной группы вызывали однократным подкожным введением раствора 17-β-эстрадиола на пропиленгликоле в дозе 30 мг/кг живой массы; контрольной группе цыплят вводили пропиленгликоль. Убой цыплят осуществляли декапитацией (по 5 гол. из группы) через 4, 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч после инъекции. Печень быстро извлекали и готовили гомогенат. Для этого к 1 г сырой ткани добавляли 9 мл среды выделения следующего состава: сахароза — 250 мМ, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) — 1 мМ, Трис-HCl — 10 мM (pH 7,6). Использовали стеклянный шариковый гомогенизатор (10-15 фрикций). Митохондриальную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования. Ядра, клеточный дебрис, неразрушенные клетки и эритроциты удаляли центрифугированием при 700 g в течение 10 мин, митохондриальную фракцию отделяли при 5000 g в течение 10 мин, затем при 10 000 g в течение 2 мин. Полученный осадок митохондрий промывали, для чего ресуспендировали в первоначальном объеме среды выделения, не содержащей ЭДТА, и осаждали в том же режиме: 10 мин при 5000 g и 2 мин при 10 000 g (всю процедуру выполняли дважды). Митохондриальную фрак-цию ресуспендировали в той же среде (конечная концентрация по белку — 60-80 мг/мл; количество белка оценивали биуретовым методом). Все манипуляции с гомогенатами печени и митохондриальной фракцией проводили в боксе при температуре 0-4 °С. В гомогенате и митохондриальной фракции учитывали содержание общего белка, РНК, ДНК. Перед измерением количества РНК и ДНК митохондрии дополнительно очищали дигитонином от примесей цитоплазматических компонентов (6).

Скорость дыхания в митохондриях определяли полярографическим методом в присутствии 10 мМ сукцината натрия при последовательном добавлении 200-500 мкМ АДФ, 40 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ), 2 мМ KCN (конечные концентрации). Среда инкубации содержала 250 мМ сахарозы, 20 мМ KH2PO4, 0,5 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6). Цитохромоксидазную активность оценивали по максимальной скорости дыхания митохондрий в присутствии насыщающих концентраций аскорбата натрия (2 мМ) с тетраметилпарафенилендиамидом (ТМФД, 2 мМ) и цитохромом С (15 мкМ). Активность транспорта ионов кальция в митохондриях определяли по потреблению кислорода в присутствии 10 мМ сукцината натрия после добавления CaCl₂ (от 50 до 100 мкМ/мг белка митохондрий). Среда инкубации состояла из 250 мМ сахарозы, 20 мМ KH₂PO₄ и 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6). Использовали общепринятые приемы изучения биологического окисления полярографическим методом (7).

У всех цыплят перед декапитацией брали из яремной вены образцы крови, добавляли гепарин в качестве антикоагулянта и получали плазму. В плазме крови измеряли содержание общего белка, триглицеридов, кальция и фосфора.

Теми же способами выделяли митохондрии из печени кур и петухов и оценивали активность дыхания и транспорта ионов кальция. Сравнивали полученные показатели для подтверждения того, что различия между митохондриями из печени цыплят и кур обусловлены не возрастом, а функциональными особенностями, связанными с вителлогенезом.

Полученные результаты обрабатывали статистически общепринятыми методами в программе Microsoft Excel.

Результаты. Введение 17-β-эстрадиола цыплятам вызывало увеличение массы печени (табл. 1): через 24 ч после эстрогенизации показатель достоверно отличался от контроля (р < 0,001) (соответственно 33,6 и 23,1 г/кг живой массы), через 96 ч — увеличился более чем в 2 раза. Содержание белка и РНК в расчете на 1 г сырой печеночной ткани было практически одинаковым в контроле и опыте, а общее повышение регистрируемых значений соответствовало росту массы органа. Возросшая величина соотношения РНК/ДНК (с 2,68 в контроле до 3,78 через 96 ч) может свидетельствовать об усилении транскрипционной активности или снижении скорости деградации РНК либо того и другого. Уменьшение количества ДНК через 24, 36 и 96 ч было обусловлено гипертрофией гепатоцитов.

Фосфопротеидный фосфор, концентрация которого в плазме крови цыплят из контрольной группы находилась на пределе чувствительности аналитического метода, появлялся в регистрируемых количествах через 12 ч после введения гормона (показатель достоверно отличался от нуля, р < 0,001), и  через 24 ч его содержание составило 104,0 мкг/мл. С увеличением периода воздействия гормона наблюдался дальнейший рост показателя. Аналогичным образом повышалось содержание триглицеридов и кальция в крови цыплят: концентрация метаболита через 12 ч выросла в 1,6 раза и достоверно отличалась от контроля (р < 0,001), через 96 ч — была уже на порядок выше даже по сравнению с зарегистрированной через 12 ч. Количество общего кальция заметно возросло через 24 ч, а через 96 ч составило 35,1 мг%, что почти в 4 раза больше, чем в контроле.
В нашем опыте 17-b-эстрадиол оказывал заметное влияние и на функциональную активность митохондрий печени. Так, если содержание ДНК в митохондриях (мтДНК) в контроле составило 0,69 мкг/мг белка, то через 4 и 12 ч оно возросло соответственно до 0,88 и 0,74 мкг/мг. Еще более высокие значения зафиксировали через 72 и 96 ч: увеличение было соответственно 1,8- и 2,5-кратным (p < 0,001). Содержание РНК в митохондриях (мтРНК) в опыте оказалось больше, чем в контроле. Наибольший рост показателя (в 1,6-2,9 раза) происходил в период с 24 до 96 ч после введения эстрадиола. Величина отношения мтРНК/мтДНК возросла, достигая через 36 ч максимального значения — 16,7, после чего несколько снизилась, оставаясь, тем не менее, выше, чем в контроле. Цитохромоксидазная активность через 4-48 ч была несколько ниже, через 72-96 ч — в 1,7 раза выше контрольного значения.

Измерение скорости дыхания митохондрий показало, что в течение 24 ч после введения гормон не оказывал какого-либо заметного влияния на окисление сукцината натрия в присутствии АДФ, в его отсутствие и не изменял скорость переноса электронов в разобщенной дыхательной цепи. Через 36-48 ч после введения эстрадиола в митохондриях наблюдалось заметное снижение скорости контролируемого и активного дыхания, а также скорости дыхания в разобщенном состоянии дыхательной цепи. Степень снижения была приблизительно одинаковой во всех состояниях митохондрий. После 72 ч у цыплят происходило увеличение этого показателя как в присутствии акцепторов фосфата (V3), так и после использования всего добавленного АДФ (V_4о), через 96 ч — заметное уменьшение V₃ при относительно высоком значении V_4о.

Характер окислительного фосфорилирования и активного транспорта в митохондриях печени у кур-несушек и эстрогенизированных цыплят был аналогичен. У кур-несушек АДФ практически необратимо стимулировал дыхание, отмечалось низкое значение коэффициента АДФ/О. Снижение показателей энергетического сопряжения дыхания и фосфорилирования наблюдали при использовании среды инкубации, содержащей ионы магния, повышение — в их отсутствие. При этом величина отношения АДФ/О возросла с 0,5 до 1,5, а скорость дыхания после использования всего добавленного АДФ уменьшилась до 9,0 и практически равнялась таковой у цыплят и взрослых петухов. У кур добавление аденозинмонофосфата (АМФ) не влияло на скорость дыхания в отсутствие Mg²⁺, но стимулировало его в присутствии этого иона. Исключение ионов магния из среды инкубации практически не влияло на дыхание митохондрий печени у цыплят и взрослых петухов. Полученные результаты позволили заключить, что у кур в митохондриях печени происходит включение аденилаткиназной реакции, которая активируется ионами магния и служит связующим звеном между окислительным фосфорилированием и процессами биосинтеза. Для митохондрий эстрогенизированных цыплят также было характерно ухудшение сопряженности дыхания и фосфорилирования в присутствии ионов магния и повышение степени сопряженности в их отсутствие.

Известно, что активный транспорт ионов кальция — одна из эндэргонических реакций в митохондриях, которая успешно конкурирует за промежуточные макроэргические соединения с процессом синтеза АТФ. В нашем опыте коэффициент Са/О для митохондрий печени у кур-несушек был в 2 раза выше, чем у цыплят и петухов (табл. 2). Это предполагает, что поглощение ионов кальция митохондриями у кур-несушек происходит с меньшей затратой кислорода, чем у цыплят и петухов. Под влиянием эстрадиола у цыплят коэффициент Са/О возрастал до значений, близких к отмеченным у кур-несушек (через 72 ч — в 1,6 раза по сравнению с контролем).

Таким образом, однократное введение цыплятам 17-β-эстрадиола в дозе 30 мг/кг живой массы вызывает увеличение массы печени, содержания ДНК и особенно РНК в печеночной ткани; через 12 ч (лаг-период) индуцируется и в дальнейшем усиливается вителлогенная функция. При активации вителлогенной функции после введения 17-β-эстрадиола в печени цыплят наблюдается два пика стимуляции биогенеза митохондрий. Первый по времени совпадает с синтезом ядерной ДНК (до 24 ч после введения эстрадиола), когда характеристики процесса окислительного фосфорилирования не отличаются от таковых в контроле. Более интенсивный второй пик регистрируется через 72-96 ч после инъекции, и в этот период активность окислительного фосфорилирования в митохондриях печени эстрогенизированных цыплят аналогична таковой у кур-несушек. Более низкие показатели сопряжения дыхания и фосфорилирования у кур-несушек и эстрогенизированных цыплят обусловлены отвлечением промежуточных макроэргических соединений на специфические биосинтезы, что подтверждается обращением эффекта ионов магния на параметры сопряжения.

Итак, функциональные изменения в печени цыплят, вызванные введением эстрадиола, и становление ее вителлогенной функции интегрированы с биогенезом митохондрий, активностью окислительного фосфорилирования и функциональной специализацией митохондрий.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. А р х и п о в  А.В. Липидное питание, продуктивность птицы и качество продуктов птицеводства. М., 2007.
2. С к у л а ч е в  В.П. Энергетика биологических мембран. М., 1989.
3. Ч е н ц о в  Ю.С. Общая цитология. М.,1995.
4. Ф и с и н и н  В.И.,  Б и р ю к о в  А.Г.,  А в д о н и н  Б.Ф. Продуктивные качества кур, дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени под влиянием янтарной и малоновой кислот. С.-х. биол., 1986, 12: 3-7.
5. Ф и с и н и н  В.И.,  О к о л е л о в а  Т.М.,  К о р ш у н о в а  Л.Г. и др. Цитохромоксидазная и фосфорилирующая активность печени ремонтных курочек в зависимости от их возраста и дозы витаминов в рационе. С.-х. биол., 1988, 3: 43-45.
6. Т р у д о л ю б о в а  М.Г. Количественное определение РНК и ДНК в субклеточных фракциях клеток животных. В сб.: Современные методы в биохимии. М., 1977: 313-316.
7. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом /Под ред. Г.М. Франка, М.Н. Кондрашовой, Е.Н. Моховой и др. М.,1973.

ABOUT ROLE OF MITOCHONDRIONS IN FORMING OF VITELLOGENOUS LIVER FUNCTION IN HENS

L.G. Korshunova

On chicken of the White Leghorn breed in scientific experiment the author studied the dynamics of an influence of oestrogenesis on liver mass, on activity of mtDNA and mtRNA synthesis, on oxidative phosphorylation. It was shown that single injection to chicken of 17-β-estradiol in the dose of 30 mg/kg of live weight induced the vitellogenous function of liver, integrated with biogenesis, functional specialization of mitochondrions, the indices of oxidative phosphoryation.

Key words: mitochondria, liver, blood, hen, oestradiol, vitellogenesis.

Оформление электронного оттиска