doi: 10.15389/agrobiology.2021.3.465rus
УДК 635.64:573.6.086.83:577.21]:58
Исследования были поддержаны грантом РНФ 16-16-10043.
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ КОМПОЗИТНЫХ РАСТЕНИЙ ТОМАТА Solanum lycopersicum L., ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНАМИ РЕЦЕПТОРОВ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ РИЗОБИЙ У ГОРОХА
Е.С. РУДАЯ, Е.А. ДОЛГИХ ✉
В основе развития бобово-ризобиального симбиоза лежит сигнальный обмен между партнерами, что обеспечивает их взаимное узнавание, активацию инфекционного процесса и программы органогенеза клубеньков. Интерес представляет изучение возможности приобретения небобовыми растениями способности к рецепции сигнальных молекул ризобий — липохитоолигосахаридных сигналов Nod-факторов и дальнейшей трансдукции сигнала. У гороха ранее были выявлены две рецепторные киназы — SYM10 и K1, которые необходимы для узнавания Nod-факторов при инициации симбиоза с ризобиями. При рецепции Nod-факторов формируется комплекс между этими двумя рецепторными киназами, что приводит к сигнальной трансдукции. В настоящей работе был осуществлен перенос двух генов, кодирующих LysM-РПК SYM10 и K1 у гороха Pisumsativum L., в растения томата Solanum lycopersicum L. с помощью агробактериальной трансформации. У композитных растений, трансформированных генами PsSym10 или PsK1, впервые выявлена возможность активации экспрессии перенесенных генов рецепторов под влиянием инокуляции типовым штаммом ризобий Rhizobiumleguminosarum bv. viciae CIAM1026. Также показано, что под влиянием рецепторов в генетически трансформированных корнях композитных растений увеличивается экспрессия генов, которые могут регулироваться компонентами «общего» сигнального пути. Целью работы было изучение возможности приобретения растениями S. lycopersicum способности к узнаванию сигнальных молекул ризобий за счет переноса генов, кодирующих рецепторы Nod-факторов у бобового растения P. sativum. Для проведения экспериментов были получены и использованы два вида конструкций в векторе pKm43GW, в которых гены рецепторов PsSym10 или PsK1 были клонированы под промотором гена экстенсина томата pSlEXT1 — pSlEXT1::PsSym10-3xFLAG::T35S и pSlEXT1::PsK1-RFP::T35S. Молодые проростки томата S. lycopersicum сорта Carmello были трансформированы штаммом Agrobacterium rhizogenes Arqua 1. Трансформированные проростки помещали на агаризованную среду Мурасиге-Скуга (MC) без сахарозы в чашках Петри и культивировали в вертикальном положении в фитотроне до появления каллуса. После этого растения переносили на среду МС c 3 % cахарозы, содержащую 0,3 мг/мл антибиотика цефотаксима, и инкубировали до появления трансгенных корней. Композитные растения переносили в вермикулит, политый 0,5× средой Fahreus и инкубировали в условиях повышенной влажности в течение 2-3 сут. После этого растения были инокулированы штаммом R. leguminosarum bv. viciae CIAM1026, содержащим ген глюкуронидазы uidA(GUS). Для анализа использовали трансформированные корни композитных растений томата без инокуляции ризобиями (контроль, 7 сут), а также трансформированные корни через 7 и 21 сут после инокуляции. Количественный анализ экспрессии генов проводили методом количественной ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). При использовании промотора pSlEXT1 наблюдали экспрессию обоих генов PsSym10 и PsK1 в генетически трансформированных корнях растений томата, при этом экспрессия усиливалась под влиянием инокуляции ризобиями. Было показано существенное (примерно в 2,0-2,5 раза) повышение экспрессии гена PsSym10 в ответ на инокуляцию ризобиями как на 7-е, так и на 21-е сут. Уровень экспрессия PsK1 оказался самым высоким через 7 сут после инокуляции в трансформированных корнях композитных растений томата по сравнению с контролем. Чтобы определить, будут ли активироваться компоненты «общего» сигнального пути под влиянием перенесенных рецепторов в композитных растениях томата, были оценены изменения в экспрессии генов S. lycopersicum SlD27,SlNSP2,SlRAM1 и SlMAPK6. Эти гены кодируют каротиноид-изомеразу (DWARF27), регулирующую синтез гормонов стриголактонов, транскрипционные факторы NSP2 и RAM1, а также митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK6). Активация экспрессии двух генов SlNSP2 иSlMAPK6 в ответ на инокуляцию может свидетельствовать о влиянии перенесенного гена K1 гороха на восприимчивость растений томата к инокуляции ризобиями.
Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, рецептор-подобные киназы, Nod-факторы, композитные растения томата, экспрессия генов.
E.S. Rudaya, E.A. Dolgikh ✉
The development of legume-rhizobial symbiosis is based on signal exchange between partners, which ensures their mutual recognition and activation of the infection process and the program of nodule organogenesis. In this regard, it is of great interest to study the possibility of acquisition by non-legume plants of the ability to perceive lipochito-oligosaccharide signal molecules of rhizobia, the Nod factors, and subsequent activation of signal transduction pathway. To study this possibility in our work, we carried out the transfer of the genes encoding receptors to Nod factors of legume plant pea Pisum sativum L. into tomato Solanum lycopersicum L. (Carmello cultivar) using the transformation with Agrobacterium rhizogenes. In pea, two receptor kinases, SYM10 and K1, were previously identified, which are necessary for the recognition of Nod factors during the initiation of symbiosis with rhizobia. Upon reception of Nod factors, a complex is formed between these two receptor kinases, which leads to signal transduction. In the present work, we carried out the transfer of two genes encoding LysM-RLK SYM10 and K1 in pea P. sativum into tomato plants S. lycopersicum using agrobacterial transformation. In composite plants transformed with PsSym10 or PsK1 genes, the possibility of expression activation of introduced receptor genes in response to inoculation with a typical rhizobial strain Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026 was shown. It was also shown that, under the influence of receptors in genetically transformed roots of composite plants, the expression of genes is increased, which can be regulated by components of the “common” signal pathway. The aim of this work was to study the possibility of acquiring the ability of S. lycopersicum plants to recognize signal molecules of rhizobia after transfer of the genes encoding receptors for Nod factors in the legume plant P. sativum. Two types of constructs in the pKm43GW vector were obtained and used, in which the PsSym10 or PsK1 genes encoding receptors were cloned under the pSlEXT1 promotor of tomato extensin gene —pSlEXT1::PsSym10-3xFLAG::T35S and pSlEXT1::PsK1-RFP::T35S. Young tomato seedlings of S. lycopersicum cv. Carmello were transformed with the Agrobacterium rhizogenes Arqua 1 strain. The transformed seedlings were placed on Murashige-Skoog (MS) agar medium without sucrose in Petri dishes and cultured in an upright position in a phytotron until callus is appeared. After that, the plants were transferred to MS medium with 3 % sucrose containing 0.3 mg/ml of the antibiotic cefotaxime and incubated until transgenic roots are appeared. Composite plants were transferred into vermiculite poured with 0.5× Fahreus medium and incubated under high humidity conditions for 2-3 days. The plants were then inoculated with R. leguminosarum bv. viciae CIAM1026 containing the uidA glucuronidase gene (GUS). For the analysis we used transformed roots of composite tomato plants without rhizobial inoculation (control, 7 days), as well as transformed roots at 7 and 21 days after inoculation. The analysis of gene expression was performed by quantitative PCR combined with reverse transcription (RT-PCR). In genetically transformed roots of tomato plants the expression of both PsSym10 and PsK1 genes was observed under the pSlEXT1 promoter, moreover the expression was enhanced under the influence of rhizobial inoculation. A significant (approximately 2.0-2.5-fold) increase in the expression of the PsSym10 gene was shown in response to inoculation with rhizobia both at 7 and 21 days. The level of PsK1 expression was found to be the highest 7 days after inoculation in the transformed roots of composite tomato plants as compared to the control. To determine whether the components of the “common” signal pathway will be activated under the influence of transferred receptors in composite tomato plants, the changes in the expression of S. lycopersicum SlD27, SlNSP2, SlRAM1, and SlMAPK6 genes were assessed. These genes encode carotenoid isomerase (DWARF27) which regulates the synthesis of the hormones strigolactones, transcription factors NSP2 and RAM1, and mitogen-activated protein kinase (MAPK6). Activation of the expression of two genes, the SlNSP2 and SlMAPK6 in response to inoculation may indicate the effect of the introduced pea K1 gene on the susceptibility of tomato plants to rhizobial inoculation.
Keywords: legume-rhizobial symbiosis, receptor-like kinases, Nod factors, composite plants, gene expression.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
