doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.306rus
УДК 636.2:591.463.1:57.086.13
ХОЛЕСТЕРИН НЕ ПОВЫШАЕТ КРИОЗАЩИТНУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
СРЕДЫ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ,
ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БЫКА
Н.В. ШИШОВА1, Н.А. КОМБАРОВА2, Ю.С. ТАРАХОВСКИЙ3,
Г.А. ДАВЫДОВА3, Л.В. ЗАЛОМОВА1, О.Ю. СЕРАЯ3, А.И. АБИЛОВ4
В настоящее время для криоконсервации семени сельскохозяйственных животных актуальной задачей остается разработка сред на основе растительных фосфолипидов, не содержащих компонентов животного происхождения. Однако в комплексе растительных липидов, в отличие от желточных, отсутствует холестерин, который играет важную роль в обеспечении криорезистентности. Известно, что обогащение клеточных мембран холестерином усиливает толерантность сперматозоидов быка к охлаждению и замораживанию (E. Mocé с соавт., 2010; E. Mocé с соавт., 2014; M.H. Fayyaz с соавт., 2016). Можно предположить, что включение холестерина в состав безжелточных сред на основе растительных лецитинов способно повысить их криозащитную эффективность. Нами впервые одновременно оценено влияние холестерина на свойства липосом или липидных частиц на основе смеси соевых фосфолипидов и на их криозащитное действие при добавлении в растворы для криоконсервации спермы быка. Цель исследования — определить, как введение холестерина в комплекс растительных липидов повлияет на физические характристики и криопротекторную функцию липидной суспензии. Для этого мы изучили динамический размер липосом и липидных частиц из обработанной ультразвуком смеси холестерина с соевым лецитином (диапазон массовой доли холестерина - 0; 8; 18; 33 и 50 %) и определили выживаемость сперматозоидов быка при замораживании и оттаивании в среде, содержащей такие липидные смеси. О жизнеспособности половых клеток судили по доле сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением (при скорости более 25 мкм/с) сразу после оттаивания и через 5 ч инкубации при 38 °С. Для приготовления суспензии использовали коммерческий лецитин марки LeciPRO 90 («Unitechem Co., Ltd», КНР) и очищенный холестерин, полученный из ланолина («Sigma-Aldrich Co.», США), для озвучивания — ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т («НПП Академприбор», Россия; 22 кГц, 60 Вт/см2, 5 мин). Показано, что введение холестерина в состав липосом из коммерческого соевого лецитина LeciPRO 90 в концентрации 18 и 33 % по массе липидов увеличивало размер липосом после ультразвукового дробления. Такие смеси формировали монодисперсную суспензию со средним размером частиц соответственно 66±6 нм и 62±11 нм. Введение холестерина в концентрации 50 % приводило к полному изменению состояния липидной суспензии с образованием сложных структур из фосфолипидно-холестериновых ламелл и кристаллов монгидрата холестерина. В концентрации 8 % холестерин не повышал криозащитную эффективность лецитина, а при 18-50 % она снижалась. При увеличении концентрации холестерина в липидной смеси до 50 % (~ 66 моль%) отмечалось некоторое повышение подвижности сперматозоидов относительно минимального значения в варианте с 33 % холестерина. Наиболее вероятная причина негативного воздействия холестерина на криозащитную эффективность липидной суспензии — ухудшение взаимодействия липосом с цитоплазматической мембраной сперматозоида за счет уплотнения упаковки фосфолипидов в липидном бислое.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, сперматозоиды, криоконсервация, холестерин, фосфолипиды, липосомы.
N.V. Shishova1, N.A. Kombarova2, Yu.S. Tarakhovsky3, G.A. Davydova3,
L.V. Zalomova1,
O.Yu. Seraya3, A.I. Abilov4
Design of plant phospholipid based extenders free of animal-derived components is urgent in farm animal semen cryopreservation. However, a complex of plant lipids, unlike the yolk complex, lacks cholesterol which plays an important role in cryoresistance of spermatozoa. Enriching spermatozoa membranes with cholesterol improves their cryotolerance (E. Mocé et al., 2010; E. Mocé et al., 2014; M.H. Fayyaz et al., 2016). We first estimated the impact of different cholesterol concentrations (0, 8, 18, 33 and 50 %) in soybean phospholipid mixtures both on morphology of obtained liposomes or lipid particles, and on their cryoprotective property as judged by the effect on motility when added to the extender at bull sperm cryopreservation. Liposome suspensions were prepared from commercial lecithin LeciPRO 90 («Unite-chem Co., Ltd», China) and purified cholesterol form lanolin («Sigma-Aldrich Co.», USA) by sonication at an ultrasound disintegrator UZDN-2T (NPP «Academpribor», Russia; 22 kHz, 60 W/cm2, 5 min). It was found that cholesterol did not notably influence the obtained liposomes at low concentration (8 %). At 18 and 33 % cholesterol in the lipid mixture the size of the liposomes increased and averaged 66±6 nm and 62±11 nm, respectively. Fifty percent cholesterol changed the lipid suspension completely resulting in complex structures formed by phospholipid-cholesterol lamellae and crystals of cholesterol monohydrate. Eight percent cholesterol did not increase a cryorpotective efficiency of lecithin, while 18-50 % cholesterol decreased its cryoprotective capacity. An increase in cholesterol concentration in the lipid mixture up to 50 % (~ 66 mol%) led to somewhat higher spermatozoa motility compared to a minimum score observed at freezing with 33 % cholesterol. The most probable cause of the negative impact of cholesterol on the cryoprotective effectiveness of lecithin suspension is impairment in liposome interaction with a sperm plasma membrane caused by condensation of phospholipid packing in a lipid bilayer.
Keywords: cattle, cryopreservation, sperm, cholesterol, phospholipids, liposomes.
1ФГУН Институт биофизики клетки РАН, |
Поступила в редакцию |
