doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.274rus
УДК 636.1:591.463.1:57.086.8
Исследования проводились при поддержке Российского научного фонда (проект № 17-16-01109).
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ
СПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭПИДИДИМАЛЬНОЙ, ЭЯКУЛИРОВАННОЙ
И
КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЕ ЖЕРЕБЦОВ
М.М. АТРОЩЕНКО1, В.В. КАЛАШНИКОВ1, Е.Е. БРАГИНА2, А.М. ЗАЙЦЕВ1
Криоконсервация спермы — важный прием сохранения генетических ресурсов животных. В коневодстве этот вопрос актуален в большей степени, чем в других отраслях животноводства, так как в настоящее время численность многих пород лошадей (особенно уникальных пород отечественной селекции) приближается к критическому уровню. Для ряда аборигенных пород из-за особенностей табунно-тебеневочной технологии содержания невозможно получение спермы для криоконсервации традиционным методом, и единственным экономически оправданным способом создания криобанков остается получение эпидимального семени. Технология получения и криоконсервации спермы производителей включает ряд критических этапов, характеризующихся снижением ее качества. К ним можно отнести процедуру взятия, разбавление, температурный шок при замораживании и оттаивании. В работе нами впервые проведено сравнительное изучение ультраструктуры эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов у одних и тех же жеребцов, что исключило влияние особенностей организма разных особей на сопоставляемый признак. С использованием электронной микроскопии показано, что на всех этапах работы со спермой наиболее уязвимым органоидом были акросомы. Преобладающей патологией при получении и криоконсервации спермы оказалось отсутствие внутреннего содержимого акросом, что ведет к их ферментной недостаточности. Частота этой патологии в свежеполученной эпидидимальной сперме составила 12,4 %, в эякулированной — 14,0 %, после замораживания и оттаивания анализируемый показатель увеличивался практически двукратно, достигая соответственно 26,5 и 27,4 %. Доля спермиев со второй по распространенности патологией — деградацией акросомы (преждевременным высвобождением ферментов, растворяющих оболочку яйцеклетки, вследствие чего утрачивается способность сперматозоида к оплодотворению) при криоконсервации возрастала на 5,9 % (p < 0,05) для эпидидимальной и на 8,9 % (p < 0,01) для эякулированной спермы. К самым устойчивым к криоконсервации органоидам относилось ядро половых клеток, однако у двух жеребцов после замораживания и оттаивания спермы отмечали изменение формы ядра и вакуолизацию хроматина сперматозоидов (частота — 1,6-6,1 %). Менее чем у 10 % спермиев наблюдали патологии митохондрий. Аксонема сперматозоидов была достаточно устойчива к криоконсервации. Наружные плотные фибриллы и фиброзная оболочка аксонемы практически не повреждались ни при получении спермы, ни при замораживании и оттаивании. Отмеченные различия по ультраструктурной целостности органоидов в пользу эпидидимальных спермиев по сравнению с эякулированными не были статистически значимыми. Таким образом, при получении спермы ультраструктурные повреждения минимальны, основные патологии проявлялись после криоконсервации. Ультраструктурные характеристики состояния сперматозоидов в эпидидимальном семени позволяют рекомендовать этот метод получения спермы для формирования криобанков в случаях, когда по тем или иными причинам отсутствует возможность воспользоваться традиционными способами. Технология формирования криобанков эпидидимальным семенем также может применяться при необходимости ранней кастрации жеребцов, в частности в спортивном и продуктивном коневодстве.
Ключевые слова: жеребцы, электронная микроскопия, эпидидимальная сперма, эякулированная сперма, криоконсервация.
M.M. Atroshchenko1, V.V. Kalaschnikov1, Ye.Ye. Bragina2, A.M. Zaitsev1
Cryopreservation of semen is an important way to preserve genetic resources. It is the most actual in horse breeding than in other livestock industries, as currently in many horse breeds, especially unique domestic breeds, the number is approaching a critical level. For many native breeds due to a specific management, year-round outdoors in herds, it is impossible to obtain sperm for cryopreservation by a traditional method using an artificial vagina, and the only cost-effective way to create cryobanks is getting epididymal semen. The technology for cryopreservation of stallion semen includes some critical steps that are characterized by a decrease in sperm quality. These are procedure for semen donation, dilution, temperature shock during freezing and thawing. For the first time a comparative transmission electron microscopy study of the ultrastructural integrity of spermatozoa was done for ejaculated and epididymal sperm in the same stallions thus avoiding the influence of different individuals on the compared parameter. Structural damage caused by cryoconservation of epididymal and ejaculated sperm was studied. It was found that acrosomes were the most susceptible and undergone the greatest impact. Its predominant pathology is the absence of internal contents (acrosome hypoplasia), resulted in enzyme deficiency. The frequency of this pathology was 12.4 % and 14.0 % for fresh epididymal and ejaculated sperm, respectively, and increased almost twofold after freezing and thawing, reaching 26.5 and 27.4 %, respectively. The rate of spermatozoa with the second most common pathology, acrosome degradation (premature release of sperm enzymes that dissolve the oocyte membrane, resulting in the loss of the ability to fertilize), after cryopreservation increased by 5.9 % (p < 0.05) and 8.9 % (p < 0.01) for epididymal and ejaculated semen, respectively. The nucleus of the sperm is one of the most resistant to cryopreservation among the organelles, though in two stallions we observed changes in the shape of the nucleus and vacuolation of chromatin after cryopreservation with a frequency of 1.6 to 6.1 %. Less than 10 % of the sperm had pathology of mitochondria. The axoneme of sperm is sufficiently resistant to cryopreservation. Outer dense fibers and fibrous membrane are almost not damaged during semen collecting as well as under semen freezing and thawing. Higher rates of ultrastructural integrity found for epididymal semen were not statistically significant. Thus, the sperm collecting results in minimal ultrastructural damage, whereas the main pathology is caused by cryopreservation. The ultrastructural integrity of spermatozoa in epididymal semen allow us to recommend this sperm collecting technique to organize cryobanks in case of impossibility of sperm collecting from stallions in traditional ways, or in need for early castration of stallions, in particular in sporting and productive horse breeding.
Keywords: stallion, electron microscopy, epididymal semen, ejaculated semen, cryopreservation.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ коневодства, |
Поступила в редакцию |
