Сельскохозяйственная биология, 2010, № 2, с. 29-33.

УДК 615.33:577.181.6:547.962.9:577.112.08

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЫ АНТИСЕПТИЧЕСКОГО КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО СРЕДСТВА КОЛМЕДОКС

И.В. КИС¹, А.И. САПОЖНИКОВА¹, Н.А. КОСТРОМИТИНОВ²

В опытах in vitro отрабатывали технологические приемы получения коллагена и изучали условия приготовления антисептического средства Колмедокс на основе коллагеновой матрицы. Показано, что доксициклин, метронидазол и хлоргексидин, растворенные в универсальном растворителе, обладали выраженным синергизмом, что повлияло на повышение антимикробной активности препаративной формы. 

Ключевые слова: коллаген, антисептическое средство, аминокислотный состав, антибактериальная активность, минимальная подавляющая концентрация (МПК), Колмедокс.

Экспериментально и клинически доказано, что коллаген представляет собой современный биоматериал с широким спектром свойств. В частности, он способствует пролиферации фибробластов (1), обладая свойствами биодеграданта, применяется при восстановлении костных дефектов (1, 2). Как пластический материал коллаген характеризуется низкой антигенностью, способен образовывать комплексы с биологически активными веществами и стимулировать регенерацию тканей (3).
В качестве биокомпозиционного материала его вводят в состав лекарственных средств, используемых в медицине и ветеринарии при различных патологиях (2, 4). Коллагенсодержащие препараты с антимикробным компонентом доксициклином (полусинтетическое производное окситетрациклина) обладают бактериостатическим действием, обусловленным подавлением белкового синтеза за счет взаимодействия антибиотика с 30S-субъединицами рибосом микробных клеток (5). Имеются данные о положительном лечебном эффекте коллагенового геля Коллост с доксициклином при пародонтозе (6). Эффект препаратов на основе коллагена с метронидазолом (7, 8) обусловлен способностью метронидазола (производное 5-нитроимидазола) превращаться в активную форму при соединении с внутриклеточными транспортными белками анаэробных микроорганизмов и простейших. При этом восстановленная 5-нитрогруппа метронидазола ингибирует синтез нуклеиновых кислот, взаимодействуя с ДНК микроорганизмов и вызывая их гибель (5).
Коллагенсодержащий препарат с метронидазолом Коллапан-М успешно используется в различных областях костной хирургии (7), коллагеновые губки с иммобилизованным метронидазолом — при лечении гнойных ран (8, 9), препарат Коллост — для лечения пародонтитов (6).
Антисептический компонент композиций с коллагеном биглюканат хлоргексидина (хлоргексидин) обладает бактериостатическим, бактерицидным, а также противопаразитарным действием за счет пролонгированной диссоциации солей хлоргексидина и последующего связывания образующихся катионов с отрицательно заряженными группами на поверхности клеток, что вызывает нарушение их осмотического равновесия (5). Фармакокинетическая особенность хлоргексидина заключается в том, что он практически не всасывается из желудочно-кишечного тракта. Благодаря катионной природе хлоргексидин хорошо связывается с кожей и слизистыми оболочками и тем самым проявляет местное антисептическое действие (10). Препараты с биглюканатом хлоргексидина предложены для применения в стоматологии (11, 12).
 Эффективность химиопрофилактики и химиотерапии полимикробных раневых инфекций можно повысить, комбинируя совместимые антимикробные компоненты, способные при сочетании взаимно усиливать активность и расширять спектр антимикробного действия.
Целью наших исследований было создание пролонгированного антисептического средства с широким спектром антимикробного действия на основе коллагеновой матрицы за счет усовершенствования технологии получения геля коллагена и подбора условий изготовления многокомпонентных препаративных форм.
Методика. Коллаген получали по запатентованной методике (13) в нашей модификации из некондиционных (порезы) шкур крупного рогатого скота (приобретены на убойных пунктах хозяйств Московской области). Шкуру разрезали на кусочки размером 5½5 см, которые помещали в емкость с перемешивающим устройством и промывали теплой водопроводной водой. После удаления промывной жидкости при постоянном перемешивании добавляли щелочной раствор, содержащий гидроксид натрия, перекись водорода и сульфид натрия в ранее подобранных концентрациях и выдерживали в течение 36 ч при 25 °С для удаления волосяного покрова и набухания коллагена. Обработанный щелочным раствором материал трижды промывали холодной водопроводной водой и один раз —  0,1 М уксусной кислотой (для нейтрализации щелочи), после чего измельчали и заливали 1 М уксусной кислотой на 3-5 сут (до образования геля).
На всех этапах используемое оборудование стерилизовали в течение 40 мин текучим паром при давлении 1 атм.
Гель коллагена исследовали на стерильность (14), содержание белка определяли методом Кьельдаля (15), аминокислот — на аминокислотном анализаторе (модель 835, «Hitachi», Япония) в Аккредитованном испытательном лабораторном центре «Биотест» МГУПБ (под руководством Л.А. Зюковой, г. Москва).
Полученный по указанной технологии коллаген использовали как основу антисептического средства. В качестве антисептических компонентов испытывали доксициклин, метронидазол и хлоргексидин, которые эффективны в монокомпонентных антисептических лекарственных формах (6-12) и не оказывают побочного действия на организм млекопитающих. Субстанции зарегистрированы в Российской Федерации и доступны для использования.
При подборе универсального растворителя препаративной комбинированной формы испытывали дистиллированную воду, монопропиленгликоль и триэтиленгликоль при разных значениях рН, температуры и в зависимости от последовательности растворения компонентов. Учитывая изоэлектрическую точку коллагена и кислотность среды в раневом содержимом (рН 5-6), готовили раствор базовой лекарственной формы.
Антимикробную активность монокомпонентных образцов и комбинированной лекарственной формы (рабочее название Колмедокс) определяли методом серийных разведений с использованием тест-культур Staphylococcusaureus и Escherichiacoli.
Полученные данные обрабатывали статистически (16).
Результаты. Описанная технология обеспечивала получение стерильного препарата коллагена; ни в одном из испытанных образцов не  отмечали микробной контаминации.
В трех серийных образцах коллагена концентрация белка составила 20,60±0,01 мг/мл. Аминокислотный состав был характерным для субстрата (табл. 1), в частности отмечалось высокое содержание глицина (5,83±0,02 мг/мл), гидроксипролина (2,64±0,01 мг/мл), пролина (2,41±0,01 мг/мл), глутаминовой кислоты (1,69±0,02 мг/мл).

Дистиллированная вода в качестве растворителя (табл. 2) не обеспечивала стабильность раствора доксициклина как в моноварианте, так и в сочетании с другими компонентами. С монопропиленгликолем и триэтиленгликолем удалось получить 2-5 % растворы доксициклина и метронидазола. Хлоргексидин обладал высокой растворимостью во всех вариантах опыта.  
Оптимальной для растворения метронидазола оказалась температура 60-80 °С при кислых значениях рН. Растворение доксициклина при температуре 70-80 °С происходило быстро, однако в течение суток (независимо от растворителя) препаративная форма приобретала темно-коричневое окрашивание вследствие быстрого окисления доксициклина. При температуре 40-60 °С доксициклин растворился полностью в течение 15-20 мин, при этом сохранилась стабильность приготовленного раствора препарата. При использвании монопропиленгликоля и триэтиленгликоля были получены сходные результаты, поэтому дальнейшие испытания проводили с  триэтиленгликолем как более дешевым и доступным реагентом.
Для получения стабильного раствора комбинированной препаративной формы важное значение имели последовательность растворения антисептических компонентов и температура растворителя: несоблюдение оптимальной процедуры приводило к образованию взвеси в течение 5-10 мин.
При выборе концентрации действующих веществ в готовой форме учитывали данные литературы (17, 18) и результаты собственных исследований антимикробной активности моно- и трехкомпонентных лабораторных образцов.
Для получения биокомпозитов в раствор антисептических субстанций вносили гель коллагена из расчета 0,1-0,5 % (по белку). Предварительные исследования показали, что оптимальное содержание коллагена в жидкой лекарственной форме — 0,1 %. При содержании коллагена 0,5 % лекарственная форма при комнатной температуре становилась гелеобразной, сохраняя это состояние в течение продолжительного времени. Для обеспечения однородности готовой формы коллаген следует вносить при перемешивании в проточном гомогенизаторе.
Оценка антибактериальной активности приготовленных монокомпонентных образцов и антисептического средства Колмедокс подтвердила (табл. 3), что по трем антимикробным компонентам значение МПК антисептического средства Колмедокс для St. aureus и E. coli составило соответственно 0,20±0,05 мкг/мл и 0,40±0,05 мкг/мл, то есть увеличилось более чем в 10 раз по сравнению с показателем наиболее активного монокомпонентного препарата, содержащего хлоргексидин. По-видимому, это обусловлено синергизмом антисептических компонентов — доксициклина, метронидазола и хлоргексидина (19).

Таким образом, предложены технологические приемы получения коллагена, подобраны условия приготовления трехкомпонентного антисептического средства Колмедокс на основе коллагеновой матрицы и показана его антимикробная активность.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. R e d d i  A.H. Implant-stimulated interface reactions during collageous bone matrix-induced bone formation. Biomed. Mater. Res., 1985, 19 (3): 233-239.
2. D e  B a l s o  A.M. Collagen gel in osseous defects oral surg. Med. Oral Pathol., 1976, 42(5): 652-659.
3. В о л о в а  Л.Т.,  К о л с а н о в  Л.В.,  К и р и л е н к о  А.Г. Биотехнологические аспекты получения коллагенсодержащих раневых покрытий и их применение в клинике. Вест. нов. мед. технол. 2002, IХ(4): 36-38.
4. С а п о ж н и к о в а  А.И. Разработка и оценка качества продукции на основе фибриллярных белков из отходов сырья животного происхождения. Автореф. докт. дис. М., 1999.
5. М а ш к о в с к и й  М.Д. Лекарственные средства, ч. 2. М., 1993.
6. Б а р е р  Г.М.,  Ц а р е в  В.Н.,  Я н у ш е в и ч  О.О. и др. Эффективность применения геля Коллост в комбинации с антибактериальными препаратами для лечения парадонтита. Пародонтология, 2002, 3(24): 62-64.
7. М и т р о н и н  А.В.,  Ц а р е в  В.Н. Клинико-микробиологическая оценка эффективности эндоканального применения биоактивного геля Коллапан в лечении хронического периодонтита. Новое в стоматологии, 2004, 5: 50-60.
8. П х а к а д з е  Т.Я.,  О к р о п и р и д з е  Г.Г.,  Б е р ч е н к о  Г.Н. и др. Микробиологические аспекты применения новых коллагенсодержащих покрытий для заживления экспериментальных ран. Тез. 4-й Межд. конф. МАКМАХ «Антимикробная терапия». М., 2001: 31.
9. К у л а к о в а  Л.А.,  А б о я н ц  Р.К.,  Т р я к и н а  Е.Г. Применение коллагеновых губок «метуракол» и «сангвикол» в лечении незаживающих трепанационных полостей среднего уха. Мат. Рос. науч.-практ. конф. «Современные проблемы заболеваний верхних дыхательных путей и уха». М., 2002: 164.
10. У в а р о в а  Е.В.,  Л а т ы п о в а  Н.Х. Применение препарата Гексикон® в лечении воспалительных заболеваний влагалища неспецифической этиологии. Репродуктивное здоровье детей и подростков, 2007, 4: 48-54.
11. С о л о в ь е в  Л.Г.,  В л а д и м и р о в а  Е.В.,  Ч е ч е т к и н а  М.М. Способ получения препарата для активации репаративного остеогенеза. Патент № 2088240 Россия МКИ A61K35/32. — № 93055814/14. Заявл. 09.12.93. Опубл. 27.08.97. М., Бюл. №  14.
12. V i n h o l i s  A.H.,  F i g u e i r e d o  L.C.,  M a r c a n t o n i o  J.E. e.a. Subgingival utilization of a 1 % cholrhexidin collagen gel for the treatment of periodontal pockets. A clinical and microbiological study. Braz. Dent. J., 2001, 12(3): 209-213.
13. С а п о ж н и к о в а  А.И.,  К а с п а р ь я н ц  С.А.,  Б е л е в ц о в а  Д.В. Способ получения коллазоля. Патент № 2129805 Россия МКИ A23J1/10, C09H1/00, C09H3/00, C14C1/08. — № 97121210/13. Заявл. 30.12.97. Опубл. 10.05.99. М., Бюл. № 13.
14. ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности. Введен 31.03.89. М., 1989.
15. ГОСТ Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Метод Кьельдаля. Введен 22.12.99. М., 2002.
16. С о б о л е в  А.Д. Основы вариационной статистики. М., 2003: 112.
17. П а н к р у ш е в а  Т.А.,  А в т и н а  Н.В.,  П а н к р у ш е в  А.А. и др. Разработка лекарственных препаратов для лечения воспалительных заболеваний пародонта. Вест. ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация, 2003, 2: 214-219.
18. В е р н и к о в с к и й  В.В. Биотехнологическая разработка некролитической мази и ее исследования. Автореф. канд. дис. Краснодар, 2007.
19. Ш а б у н и н  С.В. Современные принципы и подходы к созданию лечебно-профи-лактических средств в ветеринарии. Ветеринарный врач, 2009, 3: 15-18.

MANUFACTURING TECHNIQUES OF PREPARATIVE FORM OF ANTISEPTIC COLLAGEN-CONTAINING MEDICATION OF COLMEDOX

I.V. Kis¹, A.I. Sapozhnikova¹, N.A. Kostromitinov²

In the experiments in vitro the authors perfect the technological techniques for collagen obtaining and study the conditions of preparation of Colmedox antiseptic medication on the basis of collagen matrix. It was shown, that doxycycline, metronidazole and chlorhexidine, dissolved in universal solvent have clearly defined synergism which has an effect on the increase of antimicrobial activity of preparative form.

Key words: collagen, antiseptics, aminoacid structure, antibacterial activity, minimal suppressing concentration (MSC), Kolmedoks.

Оформление электронного оттиска