БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2021.1.20rus

УДК 633.853.55:575.1:577.21

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, Соглашение от 21 июля 2017 г. № 17-74-10233 по научному проекту: «Адаптация элементов технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9 для улучшения генома клещевины обыкновенной (Ricinus communis L.)».

 

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ U6 КЛЕЩЕВИНЫ
(Ricinus communis L.) И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ВЕКТОРОВ
ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ
CRISPR/Cas9

О.С. АЛЕКСАНДРОВ ✉, Г.И. КАРЛОВ

Клещевина — важная сельскохозяйственная культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла, широко применяемого в различных отраслях промышленности. Жмыхи и шроты, которые остаются после отжима масла, богаты белком и перспективны для использования в качестве протеиновых добавок при производстве кормов, однако содержат токсины — белок рицин и алкалоид рицинин. Одним из способов детоксификации клещевины может стать геномное редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9. Эта технология заключается в разрезании целевого участка интактной ДНК ферментом Cas9 при содействии короткого направляющего фрагмента РНК. Доставка в клетку редактируемого растения генов, кодирующих Cas9 и направляющую РНК, часто осуществляется с помощью плазмидных векторов. Для эффективного синтеза направляющей РНК в таких векторах обычно используют промоторы генов, кодирующих малые ядерные РНК. При редактировании двудольных растений чаще всего используют промотор U6 гена арабидопсиса, однако эффективность редактирования повышается, если использовать векторные конструкции с промотором редактируемого растения. В настоящей работе впервые проведена амплификация, секвенирование и анализ промоторов гена U6 клещевины. Найденные последовательности были проанализированы и использованы в конструировании CRISPR/Cas9 векторов для дальнейшего редактирования генов рицина. Нашей целью было изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины (Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). ПЦР проводили на амплификаторе C-100 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI («Сибэнзим», Россия) и необходимые олигонуклеотиды. При вырезании продуктов рестрикции из геля их очищали с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Анализ полученных последовательностей ампликонов показал, что промоторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77 %. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64 %. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов, которые могут применяться для эффективного редактирования генов клещевины, участвующих в синтезе рицина и рицинина.

Ключевые слова: клещевина, промотор, U6 гены, секвенирование, геномное редактирование, CRISPR/Cas9, конструирование векторов.

 

 

SEQUENCING OF THE U6 PROMOTERS IN CASTOR BEANS AND VECTOR CONSTRUCTION FOR CRISPR/Cas9 GENOMIC EDITING ON THEIR BASIS

O.S. Alexandrov ✉, G.I. Karlov

Castor bean is an important crop in many countries. It is mainly used to obtain the castor oil, which is widely applied in various industries. The rich protein cakes and meals are remains after the oil is pressed. They are promising for use as protein additives in the fodder production. However, it is limited due to the presence of toxins. These are ricin protein and ricinine alkaloid. One of such methods can be genomic editing using the CRISPR/Cas9 system. The technology consists in cutting the target region of the intact DNA by the Cas9 enzyme with the assistance of a short guide RNA fragment. The delivery of the Cas9 and guide RNA genes into the cell of the edited plant is often carried out by plasmid vectors. For efficient synthesis of the guide RNA in such vectors, the promoters of small nuclear RNA genes are usually used. In dicotyledonous plants editing, the promoter of the Arabidopsis U6 gene is most often used. In this work, the amplification, sequencing and analysis of the castor bean U6 promoters were carried out at the first time. The obtained sequences were analyzed and used in the construction of CRISPR/Cas9 vectors for the ricin gene editing. Our aim was to study castor bean U6 promoters with help by bioinformatics and molecular genetic approaches. Zanzibar Green and Gibzonskaya varieties of castor bean plants were used in this work. DNA was isolated from young leaves. The preparation of sequences, alignments and homology level calculation were carried out by GenDoc program (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Primers for amplification of castor bean U6 promoters were designed by Primer3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). PCR was performed using a C-100 PCR machine (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). PCR products were separated in 1.5 % agarose gel at 6 B/cm in the Sub-Cell GT electrophoresis camera (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). The amplicons were purified with the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The purified amplicons were cloned into the pAL2-T vector (Evrogen, Russia) according to protocol of manufacturer. In the CRISPR/Cas9 vector construction, the pRGE31, HindIII and SbfI restriction enzymes (Sibenzyme, Russia) and nucleotides were used. Purification of the digested products was carried out with the GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). Bioinformatic search were conducted in the GenBank base, and 12 scaffolds with the castor bean U6 gene were found. Six promoters with intact USE and TATA-box elements of regulation were used in the primer design for amplification with cv. Zanzibar Green and cv. Gibzonskaya DNA matrices. One fragment PCR products were cloned and sequenced. The analysis of the obtained amplicon sequences reveled that promoter regions of two studied varieties were similar. The level of promoter identity from different amplicons ranged within 51-77 %. In comparison of these promoters with ones from other plants, the level of homology was 42-64 %. The promoter sequences with intact USE and TATA-box motifs were used in construction of the CRISPR/Cas9 vectors which can be used for efficient editing of the castor bean genes involved in the ricin and ricinine synthesis.

Keywords: castor beans, promoter, U6 gene, sequencing, genome editing, CRISPR/Cas9, vector construction.

 

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
биотехнологии
,
127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42,
e-mail: olegsandrov@gmail.com ✉, karlovg@gmail.com

Поступила в редакцию
13 июля 2020 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ