doi: 10.15389/agrobiology.2024.5.927rus
УДК 579.841.3:579.64:579.262:582.736
Исследование проводилось с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект РНФ № 20-76-10042-П).
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СИМБИОТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КЛУБЕНЬКОВЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ ОСТРОЛОДОЧНИКА ТАЙМЫРСКОГО (Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love), АСТРАГАЛА ХОЛОДНОГО (Astragalus frigidus (L.) A.Gray) И АСТРАГАЛА ТУГАРИНОВА (Astragalus tugarinovii Basil.) ИЗ АРКТИЧЕСКОЙ ЯКУТИИ
И.Г. КУЗНЕЦОВА1 ✉, Д.C. КАРЛОВ1, П.В. ГУРО1, А.Л. САЗАНОВА1,
Н.Ю. ТИХОМИРОВА1, Н.Н. ЛАЩИНСКИЙ2, А.А. БЕЛИМОВ1,
В.И. САФРОНОВА1
Бобовые растения обладают значительным потенциалом для интродукции в арктических регионах России. Одно из ключевых свойств бобовых растений — способность формировать азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями (ризобиями). Однако изучению биоразнообразия и симбиотической эффективности арктических ризобий на территории России уделяется недостаточно внимания. В настоящей работе впервые описаны 13 штаммов порядка Hyphomicrobiales (ранее Rhizobiales), изолированных из клубеньков Oxytropis taimyrensis, Astragalus frigidus и A. tugarinovii, произрастающих в Арктической Якутии. Изучена способность девяти ризобиальных штаммов Rhizobium sp. 7/1-1, 19-1/1, 20-1/1 и 33-1/1, R. giardinii 20/1-1, M. norvegicum 20/1-4 и Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 и 32-2/1 нодулировать дикорастущие арктические бобовые Oxytropis adamsiana и Astragalus frigidus и кормовые бобовые Trifolium repens и Medicago sativa в условиях микровегетационного опыта. Целью работы было выделение и изучение генетического разнообразия штаммов порядка Hyphomicrobiales, изолированных из клубеньков дикорастущих бобовых Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love,Astragalusfrigidus(L.) A.Gray и AstragalustugarinoviiBasil., собранных в Арктической зоне Якутии, а также выявление способности ризобиальных штаммов формировать азотфиксирующие клубеньки на корнях кормовых и дикорастущих бобовых растений Trifolium repens L., Medicago sativa L., Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev и Astragalus frigidus (L.) A.Gray в условиях микровегетационного эксперимента по кросс-нодуляции. Корневые клубеньки дикорастущих популяций O. taimyrensis, A. frigidus, A. tugarinovii были собраны в 2021 году в окрестностях оз. Севастьян-Кюеле и на о. Тит-Ары в ходе российско-немецкой экспедиции в дельту реки Лены. Штаммы микроорганизмов выделяли по стандартной методике с использованием маннито-дрожжевой питательной среды YMA. Геномную ДНК из чистых культур выделяли с помощью наборов DNeasy Blood&Tissue kit («QIAGEN N.V.», Германия) и Monarch® («New England Biolabs», США). Первичная идентификация штаммов была проведена методом ПЦР с последующим секвенированием последовательностей фрагмента маркерного гена 16S рРНК (900-1400 п.н.) (rrs). Способность девяти арктических штаммов из рода Rhizobium и Mesorhizobium формировать азотфиксирующие клубеньки на корнях Trifolium repens L., Medicago sativa L., O. adamsiana и A. frigidus изучена в условиях стерильного микровегетационного опыта. Изучаемые штаммы были выделены в настоящей работе и ранее из клубеньков арктических бобовых Lathyrus palustris L., Vicia cracca L. и Hedysarum arcticum B. Fedtsch, произрастающих в дельте р. Лена. Растения культивировали в стерильных стеклянных сосудах объемом 50 мл, содержащих 3 г вермикулита и 6 мл среды Красильникова-Кореняко. Проростки были инокулированы суспензиями индивидуальных штаммов в количестве 106 клеток/сосуд. В качестве положительного контроля использовали коммерческие штаммы Rhizobium leguminosarum RCAM1365 и Sinorhizobium meliloti RCAM1750 из Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург). Неинокулированные растения служили отрицательным контролем. По окончании культивирования проводили подсчет клубеньков и определяли сырую биомассу растений. Азотфиксирующую активность определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа GC-2014 («Shimadzu», Япония). Полученные изоляты были отнесены к родам Rhizobium (сем. Rhizobiaceae), Mesorhizobium (сем. Phyllobacteriaceae), Bosea (сем. Boseaceae) и Tardiphaga (сем. Bradyrhizobiaceae). Штаммы Rhizobium sp. 7/1-1, Tardiphaga robiniae 7/2-2 и 7/4-2 были выделены из A. tugarinovii, штаммы Mesorhizobium sp. 25-2/1, 25А/5-1, Bosea sp. 25А/1-3, B. lathyri 25А/2-1, B. psychrotolerans 25А/2-2 и 25А/4-1 — из A. frigidus, тогда как штаммы Mesorhizobium sp.9-4/1, T. robiniae 9/1-5, 9/3-1 и 9/5-1 — из клубеньков O. taimyrensis. В условиях стерильного микровегетационного опыта штамм R. giardinii20/1-1 не формировал клубеньки ни в одном из вариантов инокуляции, в то время как остальные восемь штаммов были способны образовывать как неэффективные, так и азотфиксирующие клубеньки в зависимости от варианта инокуляции бобовых растений. В отношении местных арктических видов O. adamsiana и A. frigidus более активными оказались штаммы, выделенные из местных видов бобовых (O. taimyrensis, A. frigidus, H. arcticum), в то время как культурные растения M. sativa и T. repens оказались отзывчивее на инокуляцию штаммами, выделенными из заносных растений L. palustris и V. cracca. Способность O. adamsiana формировать эффективный симбиоз с M. norvegicum 20/1-4, Mesorhizobium sp. 9-4/1 и 25-2/1, выделенными соответственно из представителей бобовых родов Hedysarum, Oxytropis и Astragalus,свидетельствует о низкой хозяйской специфичности этого вида растений, что, возможно, позволяет ему использовать ресурсный потенциал широкого спектра симбиотических микроорганизмов, обитающих в почве различных регионов Арктики.Вид O. adamsiana широко распространен на Крайнем Севере и служит важным высокобелковым компонентом рациона питания местных животных, что дает основания отнести его к перспективным видам при создании многолетних пастбищных и сенокосных фитоценозов в экстремальных условиях Арктики.
Ключевые слова: Арктическая Якутия, бобовые растения, пастбищные и сенокосные агрофитоценозы, бобово-ризобиальный симбиоз, азотфиксирующие клубеньковые бактерии.
I.G. Kuznetsova1 ✉, D.S. Karlov1, P.V. Guro1, А.L. Sazanova1,
N.Yu. Tikhomirova1, N.N. Lashchinskiy2, А.А. Belimov1, V.I. Safronova1
Legumes have significant potential for introduction into the Arctic regions of Russia. One of the key characteristics of legumes is the ability to form nitrogen-fixing symbioses with nodule bacteria (rhizobia). However, insufficient attention has been paid to the study of the biodiversity and symbiotic efficiency of Arctic rhizobia in Russia. The present work describes for the first time 13 strains of the order Hyphomicrobiales (formerly Rhizobiales) isolated from nodules of Oxytropis taimyrensis, Astragalus frigidus and A. tugarinovii growing in Arctic Yakutia. The ability of nine rhizobial strains Rhizobium sp. 7/1-1, 19-1/1, 20-1/1 and 33-1/1, R. giardinii 20/1-1, M. norvegicum 20/1-4 and Mesorhizobium sp. 9-4/1, 25-2/1 and 32-2/1 to nodulate the wild Arctic legumes Oxytropis adamsiana and Astragalus frigidus and the fodder legumes Trifolium repens and Medicago sativa was investigated under the conditions of a sterile test-tube experiment. The aim of the work was to isolate and study the genetic diversity of strains of the order Hyphomicrobiales isolated from nodules of the wild legumes Oxytropis taimyrensis (Jurtz.) A. et D. Love, Astragalus frigidus (L.) A. Gray and Astragalus tugarinovii Basil, collected in the Arctic zone of Yakutia, and to determine the ability of rhizobial strains to form nitrogen-fixing nodules on the roots of fodder and wild legumes Trifolium repens L., Medicago sativa L., Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev and Astragalus frigidus (L.) A.Gray under the conditions of a sterile test-tube cross-nodulation experiment. Root nodules of wild populations of O. taimyrensis, A. frigidus, A. tugarinonovii were collected in 2021 near the lake Sevastyan-Kyule and on Tit-Ary during the Russian-German expedition to the Lena River Delta. Rhizobial strains were isolated from legume nodules by standard methods using mannitol-yeast YMA nutrient medium. Genomic DNA was isolated from pure cultures using the DNeasy Blood&Tissue Kit (QIAGEN, Germany) and Monarch® (New England Biolabs, USA). The primary identification of the strains was carried out by PCR followed by sequencing of the 16S rRNA marker gene (rrs) fragment (900-1400 bp). The ability of nine Arctic strains of the genera Rhizobium and Mesorhizobium to form nitrogen-fixing nodules on the roots of Trifolium repens L., Medicago sativa L., O. adamsiana and A. frigidus was studied under the conditions of sterile test-tube experiment. The strains studied were isolated in the present work and previously from nodules of the Arctic legumes Lathyrus palustris L., Vicia cracca L. and Hedysarum arcticum B. Fedtsch growing in the Lena River delta. Plants were grown in sterile 50 ml glass vessels containing 3 g vermiculite and 6 ml of Krasilnikov-Korenyako medium. Seedlings were inoculated with suspensions of individual strains at 106 c ells/vessel. Commercial strains of Rhizobium leguminosarum RCAM1365 and Sinorhizobium meliloti RCAM1750 from the Russian Collection of Agricultural Microorganisms (RCAM, ARRIAM, St. Petersburg) were used as positive controls. Non-inoculated plants were used as negative controls. At the end of cultivation, nodules were counted and crude plant biomass was determined. Nitrogen fixation activity was determined by the acetylene method using a GC-2014 gas chromatograph (Shimadzu, Japan). The obtained isolates were assigned to the genera Rhizobium (family Rhizobiaceae), Mesorhizobium (family Phyllobacteriaceae), Bosea (family Boseaceae) and Tardiphaga (family Bradyrhizobiaceae). The strains Rhizobium sp. 7/1-1, Tardiphaga robiniae 7/2-2 and 7/4-2 were isolated from A. tugarinovii, the strains Mesorhizobium sp. 25-2/1, 25A/5-1, Bosea sp. 25A/1-3, B. lathyri 25A/2-1, B. psychrotolerans 25A/2-2 and 25A/4-1 were isolated from A. frigidus, whereas the strains Mesorhizobium sp. 9-4/1, T. robiniae 9/1-5, 9/3-1 and 9/5-1 were isolated from nodules of O. taimyrensis. Under sterile test-tube experiments the strain R. giardinii 20/1-1 did not form nodules in any of the inoculation variants, whereas the other eight strains were able to form both ineffective and nitrogen-fixing nodules depending on the legume inoculation variant. With respect to the native Arctic species O. adamsiana and A. frigidus, strains isolated from native legumes (O. taimyrensis, A. frigidus, H. arcticum) were more active, whereas the cultivated plants M. sativa and T. repens were more responsive to inoculation with strains isolated from introduced plants L. palustris and V. cracca. The ability of O. adamsiana to form an effective symbiosis with M. norvegicum 20/1-4, Mesorhizobium sp. 9-4/1 and 25-2/1, isolated from representatives of the legume genera Hedysarum, Oxytropis and Astragalus, respectively, indicates a low host specificity of this plant species, which may presumably allow it to use the resource potential of a wide range of symbiotic microorganisms inhabiting the soil of various Arctic regions. The O. adamsiana species is widespread in the Far North and is an important high-protein component of the diet of local animals, which makes it a promising species for the establishment of perennial pasture and hay phytocenoses in extreme Arctic conditions.
Keywords: Arctic Yakutia, legumes, pasture and hay agrophytocenoses, legume-rhizobial symbiosis, nitrogen-fixing nodule bacteria.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
