doi: 10.15389/agrobiology.2025.3.503rus
УДК 635.63:632
Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ 4071, а также в рамках темы 0598-2014-0018.
ФОТОДИНАМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ИНДУЦИРУЮТ
УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИ ОГУРЦА (Cucumis sativus L.)
К ОЛИВКОВОЙ ПЯТНИСТОСТИ
Т.Д. ПАСЕЧНИК ✉, В.П. ЛАПИКОВА, Т.С. РОМАНОВА, А.А. АВЕРЬЯНОВ
Индуцированная болезнеустойчивость растений перспективна для практического использования, поскольку задействует их внутренние ресурсы и позволяет снизить нагрузку на окружающую среду. Показано, что вещества, влияющие на про-/антиокислительный баланс, участвуют в механизме системной приобретенной устойчивости. Подобной способностью обладают и фотодинамически активные вещества. В настоящей работе впервые установлено, что относящиеся к этой группе соединений метиленовый синий, бенгальский розовый и 2-меркапто-пиридин-N-оксид защищают растения огурца от оливковой пятнистости (возбудитель Cladosporium cucumerinum Ell. et Arth.), как и известные индукторы системной устойчивости (K2HPO4 и b-аминомасляная кислота). Цель — изучить защитное действие фотодинамически активных веществ в отношении оливковой пятнистости, сравнить его с таковым у известных индукторов болезнеустойчивости и исследовать участие активных форм кислорода в осуществлении механизма индукции. Были испытаны известные и предполагаемые индукторы болезнеустойчивости — K2HPO4, БАМК (b-аминомасляная кислота), фотодинамические красители бенгальский розовый (БР) и метиленовый синий (МС), светозависимый источник гидроксильного радикала 2-МПНО (2-меркапто-пиридин-N-оксид). Растения огурца (Cucumis sativus L.) восприимчивого к оливковой пятнистости сорта Феникс выращивали в натуральной почве в климатической камере Conviron EF7 («Conviron», Канада). На стадии 1-го настоящего листа растения обрабатывали растворами исследуемых веществ (10 капель на лист, контроль — вода). Примерно через 2 нед подсчитывали долю капель, давших ожоги. Через 6-8 сут после обработки у половины растений во всех вариантах следующий, 2-й лист заражали суспензией спор Cladosporium cucumerinum штамма C5 в концентрации 105 спор/мл. У другой половины растений на 2-й лист наносили капли воды (10 капель по 20 мкл). Растения помещали в темный термостат (Смоленское СКТБ СПУ, Россия) при 18 °С на 22-24 ч. Через 6-8 сут учитывали симптомы. Для получения диффузатов 1-го листа на него наносили капли воды или исследуемых растворов (10 капель по 20 мкл каждая). Через 24 ч их удаляли. В те же самые места помещали такие же капли дистиллированной воды. Еще через 1 сут их собирали, центрифугировали 10 мин при 8000 g, использовали супернатант. Для получения диффузатов незараженных листьев на них наносили воду, для получения диффузатов зараженных листьев — суспензию спор. Споровые диффузаты получали из суспензии спор. Образование супероксидного радикала в диффузатах определяли по окислению экзогенного адреналина. Для учета прорастания спор воду, диффузаты или тестируемые растворы (по 40 мкл) смешивали с 5 мкл суспензии (3,5×104 спор/мл) и 5 мкл воды. Материал инкубировали в темноте 24 ч в климатической камере, затем фиксировали этанолом (1-2 капли на лунку) и подсчитывали проросшие споры. Чтобы судить об участии АФК в механизме действия диффузатов на споры, вместо 5 мкл воды в диффузаты добавляли либо антиоксиданты (50 мкг/мл супероксиддисмутазы или 50 мкг/мл каталазы), либо перехватчики гидроксильного радикала (10 мМ маннит или 1 мМ формиат натрия). Затем так же подсчитывали проросшие споры. При исследовании влияния света на прорастание спор смесь диффузатов со спорами освещали в течение 1 ч при 90 мкмоль·м-2·с-1, затем инкубировали 23 ч в темноте. Для предварительной оценки природы веществ, выделяемых листьями, проверяли, как кипячение диффузата (1 ч на водяной бане) влияет на прорастание спор. Также исследовали влияние предполагаемых индукторов на прорастание спор. Растворы препаратов (45 мкл) смешивали с 5 мкл суспензии (3,5×104 спор/мл) и проращивали в тех же условиях на свету и в темноте. Установлено, что испытанные вещества локально повреждали 1-й лист. Степень развития болезни на 2-м листе в вариантах с обработкой была меньше, что говорит об индукции системной устойчивости. Степень подавления болезни при обработке фотосенсибилизаторами была примерно такой же, как при обработке известными индукторами. На 1-м листе образование супероксида при обработке фотосенсибилизаторами и известными индукторами было выше, чем при обработке водой. Эти же обработки стимулировали образование супероксида как в незараженных, так и в зараженных 2-х листьях. Диффузаты незараженных листьев необработанных растений стимулировали прорастание спор относительно прорастания в воде. БР, МС, K2HPO4 и БАМК снижали стимуляцию, 2-МПНО придавал фунгитоксичность. Диффузаты зараженных листьев необработанных растений прорастание не стимулировали. При обработках исследованными веществами прорастание в диффузатах снижалось (за исключением K2HPO4), что указывало на выделение зараженными растениями фунгитоксичных веществ. Поскольку экзогенные антиоксиданты не влияли на прорастание спор в диффузатах листьев, действие экзометаболитов реализуется не через АФК. Свет усиливал фунгитоксичность, следовательно, некоторые их этих экзометаболитов — фотосенсибилизаторы. После кипячения диффузатов частота прорастания была выше, чем в не подвергавшихся кипячению образцах. Это указывает на термолабильную природу возможных ингибиторов. При добавлении к спорам исследованные вещества в той или иной степени подавляли прорастание. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования веществ, способствующих активации кислорода, включая фотосенсибилизаторы, в качестве индукторов устойчивости. Они могут быть не только индукторами, но и полифункциональными фунгицидами, оказывая как системное, так и контактное действие.
Ключевые слова: Cucumis sativus, Cladosporium cucumerinum, индукция болезнеустойчивости растений, активные формы кислорода, фотосенсибилизаторы.
T.D. Pasechnik ✉, V.P. Lapikova, T.S. Romanova, A.A. Aver’yanov
Induced disease resistance of plants is promising for practical use, since it involves internal plant resources and allows reducing the load on the environment. substances affecting the pro/antioxidant balance are shown to participate in the mechanism of systemic acquired resistance. Photodynamically active substances also have a similar ability. This work demonstrates for the first time the ability of photodynamically active substances (methylene blue, Bengal rose and 2-mercapto-pyridine-N-oxide) to protect cucumber plants like the known inducers of systemic resistance (K2HPO4 and b-aminobutyric acid). The objective is to study the protective action of photodynamically active substances on cucumber scab, compare it with that of the known disease resistance inducers and investigate the participation of active oxygen species in the implementation of the induction mechanism. Known and suspected disease resistance inducers were tested: K2HPO4, BABA (β-aminobutyric acid), photodynamic dyes Bengal rose (BR) and methylene blue (MB), light-dependent source of hydroxyl radical 2-MPHO (2-mercapto-pyridine-N-oxide). Cucumber plants (Cucumis sativus L.) of the Phoenix variety susceptible to cucumber scab were grown in natural soil in a Conviron EF7 climate chamber (Conviron, Canada). At the stage of the 1st true leaf, the plants were treated with solutions of the studied substances (10 drops per leaf, water as control). After approximately 2 weeks, the proportion of drops that caused burns was calculated. 6-8 days after treatment, in half of the plants in all variants, the next, 2nd leaf was infected with a suspension of Cladosporium cucumerinum Ell. et Arth. strain C5 spores at a concentration of 105 spores/ml. In the other half of the plants, drops of water (10 drops of 20 µl) were applied to the 2nd leaf. The plants were placed in a dark thermostat (Smolensk SKTB SPU, Russia) at 18 °С for 22-24 h. Symptoms were counted 6-8 days later. To obtain diffusates of the 1st leaf, drops of water or the studied solutions (10 drops of 20 μl each) were applied to it. They were removed after 24 h. The same drops of distilled water were put in the same points. After another 24 h, they were collected, centrifuged for 10 min at 8000 g, and the supernatant was used. To obtain diffusates of uninfected leaves, water was applied to them. The spore suspension was applied on leaves to obtain diffusates of infected ones. Spore diffusates were obtained from the spore suspension. The formation of superoxide radical was analyzed in diffusates by the oxidation of exogenous adrenaline.To assess spore germination, water, diffusates, or test solutions (40 μl each) were mixed with 5 μl of suspension (3.5×104 spores/ml) and 5 μl of water. The material was incubated in the dark for 24 h in a climatic chamber, then fixed with ethanol (1-2 drops per well), and germinated spores were counted. To assess the involvement of ROS in the action of diffusates on spores, antioxidants were added instead of 5 μl of water, the 50 μg/ml of SOD or 50 μg/ml of catalase, or hydroxyl radical scavengers, the 10 mM mannitol or 1 mM sodium formate. Then, germination was counted in the same way. To study effect of light on germination, a mixture of diffusates with spores was illuminated for 1 h at 90 μmol·m-2·s-1 and then incubated for 23 h in the dark. For a preliminary assessment of the nature of substances secreted by the leaves, we checked how boiling the diffusate (1 h in a water bath) affects spore germination. The effect of putative inducers on spore germination also was studied. The preparation solutions (45 μl) were mixed with 5 μl of suspension (3.5×104 spores/ml) and germinated under the same conditions, in the light and in the dark. It was found that the tested substances locally damaged the 1st leaf. The degree of disease development on the 2nd leaf in the variants with treatment was less, which indicates the induction of systemic resistance. The degree of disease suppression during treatment with photosensitizers was approximately the same as during treatment with known inducers. On the 1st leaf, superoxide formation during treatment with photosensitizers and known inducers was higher than during treatment with water. The same treatments stimulated superoxide formation in both uninfected and infected second leaves. Diffusates of uninfected leaves of untreated plants stimulated spore germination relative to germination in water. BR, MS, K2HPO4 and BAMK reduced stimulation, 2-MPNO imparted fungitoxicity. Diffusates of infected leaves of untreated plants did not stimulate germination. When treated with the studied substances, germination in diffusates decreased (except for K2HPO4), which indicated the release of fungitoxic substances by the infected plants. Since exogenous antioxidants did not affect spore germination in leaf diffusates, the action of exometabolites is not realized through ROS. Light increased fungitoxicity, therefore, some of these exometabolites are photosensitizers. Germination was higher in boiled diffusates than in unboiled ones, and germination increased during infection. This indicates a thermolabile nature of possible inhibitors. When added to spores, the studied substances suppress germination to a varying degree. The results obtained indicate the long-term use of substances that promote oxygen activation, including photosensitizers, as resistance inductors. They can be not only inductors, but also polyfunctional fungicides, exerting both systemic and contact action.
Keywords: Cucumis sativus, Cladosporium cucumerinum, cucumber scab, plant disease resistance, induced resistance, reactive oxygen species, polyfunctional fungicides.
ФГБНУ Всероссийский НИИ фитопатологии, | Поступила в редакцию 12 августа 2024 года
|
