doi: 10.15389/agrobiology.2025.3.445rus
УДК 633.18:581.1:576.32/.36:577.24
Использовано оборудование Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-14-00096, https://rscf.ru/project/22-14-00096/.
ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ АКВАПОРИНОВ ПЛАЗМАЛЕММЫ И ТОНОПЛАСТА ПОДСЕМЕЙСТВ PIP И TIP В ХОДЕ РОСТА РАСТЯЖЕНИЕМ КЛЕТОК КОЛЕОПТИЛЕЙ ПРОРОСТКОВ РИСА, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ СКОРОСТЬЮ РОСТА В УСЛОВИЯХ НОРМОКСИИ И ЗАТОПЛЕНИЯ
А.А. КИРПИЧНИКОВА, П.Д. СМИРНОВ, Г.В. ДАНЕЛИЯ,
В.В. ЕМЕЛЬЯНОВ, М.Ф. ШИШОВА ✉
Колеоптили злаков характеризуются достаточно ограниченным временным интервалом развития и выполняют защитную функцию. У гидрофитного злака риса посевного (Oryza sativa L.) за счет способности клеток колеоптилей к росту растяжением осуществляется защита проростка от недостатка кислорода при затоплении. Резкое удлинение клеток сопровождается интенсивной вакуолизацией. Этот процесс обусловлен усилением транспорта воды через плазмалемму и тонопласт, который осуществляется посредством транспортеров группы аквапоринов. В работе нами впервые приведены данные, позволившие выявить изменения представленности аквапринов семейств PIP1 и TIP1 в клетках колеоптилей проростков риса, развивающихся в условиях нормоксии и затопления. Цель работы состояла в оценке динамики содержания аквапоринов с преимущественной локализацией в плазмалемме и тонопласте клеток колеоптилей в процессе роста растяжением у риса при аэрации и дефиците кислорода. Использовали семена двух сортов риса отечественной селекции — Аметист (медленно растущий) и Кубань 3 (быстро растущий). Семена поверхностно стерилизовали и проращивали (по 50 шт.) в гидропонных условиях в темноте при 29 °С на стеклянных мостках (контрольные растения) или создавали условия затопления в банках объемом 750 мл с использованием 4 % питательного раствора Кнопа. Для определения длины клеток центральной части колеоптилей изготавливали микропрепараты. Их фотосъемку выполняли с помощью светового микроскопа Leica DM 2500 и фотокамеры Leica DFC450 C («Leica Micro-systems GmbH», Германия) при увеличении ×20. Общую микросомальную фракцию получали из клеток колеоптилей проростков при температуре 4 °С. Содержание белка в пробах определяли по микрометоду Брэдфорда с использованием красителя Coumassie Brilliant Blue G250. Поглощение красителя, сорбированного на белках, измеряли на планшетном спектрофотометре SPECTROstar Nano («BMG Labtech», Германия) при l = 595 нм. Концентрацию белка в пробах определяли на основе калибровочного графика, построенного с использованием раствора яичного альбумина на 150 мМ сахарозе и 10 мМ Tris-MES. Белки разделяли методом денатурирующего электрофореза в 10 % полиакриламидном геле. Содержание аквапоринов PIP1 с преимущественной локализацией на плазмалемме и TIP1 с преимущественной локализацией на тонопласте в составе общей микросомальной фракции оценивали посредством иммуноблот-анализа с использованием специфичных поликлональных антител. Проведенный микроскопический анализ длины клеток центральной части колеоптилей выявил завершение роста у проростков сорта Кубань 3 на 5-е сут развития в аэробных условиях. Удлинение клеток колеоптилей у сорта Аметист было незначительным за весь тестируемый период. При затоплении у колеоптилей сорта Кубань 3 отмечали почти 2-кратное удлинение клеток уже на 3-и сут прорастания по сравнению с контролем. Более интенсивный рост при затоплении сохранялся до 7-х сут прорастания. У сорта Аметист на 3-и сут выявленные различия были не столь велики, как у сорта Кубань 3, однако к 5-м сут длина клеток увеличивалась почти в 3 раза. В процессе удлинения клеток происходило изменение содержания белка во фракции клеточных эндомембран. Вследствие значительного увеличения размеров клеток на 5-е сут после прорастания происходило почти 3-кратное снижение концентрации белка микросомальной фракции. Этот процесс продолжался, хоть и не столь интенсивно и дальше, к 7-м сут развития проростка. Снижение содержания белка было отмечено как для сорта Кубань 3, так и для сорта Аметист. При недостатке кислорода (затопление) оно оказалось менее интенсивным. С помощью иммуноблоттинга показана неравная динамика накопления белков аквапоринов подсемейств PIP1 и TIP1 как при аэробном развитии проростков риса, так и при недостатке кислорода. У проростков сорта Кубань 3 в отличие от сорта Аметист накопление аквапоринов PIP1 соответствовало изменению интенсивности удлинения клеток колеоптилей. Однако независимо от сорта и количества кислорода при прорастании содержание вакуолярных аквапоринов TIP1 постепенно увеличивалось. Полученные данные указывают на различия функционального значения аквапоринов плазмалеммы и тонопласта в процессе роста растяжением клеток колептилей в условиях нормоксии и недостатка кислорода.
Ключевые слова: аквапорины, затопление, колеоптили, рис, Oryza sativa L.
А.А. Kirpichnikova, P.D. Smirnov, G.V. Daneliia, V.V. Yemelyanov,
M.F. Shishova✉
Coleoptiles of cereals are characterized by a rather limited time interval of development and perform a protective function. In the hydrophytic cereal rice (Oryza sativa L.), the ability of coleoptile cells to grow by elongation protects the seedling from oxygen deficiency during flooding. Sharp Cell elongation is accompanied by intense vacuolization. This process is due to increased water transport through the plasma membrane and tonoplast, which is carried out by special transporters of the aquaporin group. In the presented work, for the first time, data were obtained that made it possible to reveal a crosslink between changes in the amount of plasma membrane aquaporins of the PIP1 and TIP1 subfamilies and the intensity of cell elongation in coleoptiles of rice seedlings both under normoxia and hypoxia and to reveal the unequal functional significance of plasma membrane and tonoplast aquaporins during cell elongation. The aim of the work was to evaluate the dynamics of the content of aquaporins with predominant localization in the plasma membrane and tonoplast of coleoptile cells during elongation growth in rice under aeration and oxygen deficiency. Seeds of two rice varieties of domestic selection were used: Amethyst (slow-growing) and Kuban 3 (fast-growing). The seeds were surface sterilized and germinated (50 pcs.) under hydroponic conditions in the dark at 29 °С on glass walkways (control plants) or flooded in 750 ml jars using 4 % Knop nutrient solution. Micropreparations were made to determine the length of the cells in the central part of the coleoptiles. They were photographed using a Leica DM 2500 light microscope and a Leica DFC450 C camera (Leica Microsystems GmbH, Germany) at a magnification of 20½. The total microsomal fraction was obtained from coleoptile cells of seedlings at a temperature of 4 °С. The protein content in the samples was determined by the Bradford micromethod using the Coumassie Brilliant Blue G250 dye. The absorption of the dye adsorbed on the proteins was measured on a SPECTROstar Nano plate spectrophotometer (BMG Labtech, Germany) at l = 595 nm. The protein concentration in the samples was determined based on a calibration graph constructed using a solution of egg albumin in 150 mM sucrose and 10 mM Tris-MES. The proteins were separated by denaturing electrophoresis in 10% polyacrylamide gel. The content of aquaporins PIP1 with predominant localization on in the plasma membrane and TIP1 with predominant localization in the tonoplast in the total microsomal fraction was estimated by immunoblot analysis using specific polyclonal antibodies. Microscopic analysis of the length of cells in the central part of coleoptiles revealed the completion of growth in the seedlings of the Kuban 3 variety on the 5th day of development under aerobic conditions. Elongation of coleoptile cells in the Ametist variety was low intense throughout the tested period. When flooded, coleoptiles of the Kuban 3 variety showed almost 2-fold elongation of cells already on the 3rd day of germination compared to the control. More intensive growth under flooding persisted until the 7th day of germination. In the Ametist variety, the differences revealed on the 3rd day were not as great as in the Kuban 3 variety, but by the 5th day the cell length increased almost 3 times. During cell elongation, the protein content in the fraction of cellular endomembranes changed. Due to a significant increase in cell size on the 5th day after germination, there was an almost 3-fold decrease in the concentration of protein in the microsomal fraction. This process continued, although not so intensively, further, by the 7th day of seedling development. A decrease in protein content was noted for both the Kuban 3 and Ametist varieties. Under oxygen deficiency (flooding), it was less pronounced. Using immunoblotting, unequal dynamics of accumulation of proteins of the PIP1 and TIP1 subfamilies aquaporins was shown both during aerobic development of rice seedlings and under oxygen deficiency. The accumulation of PIP1 aquaporins corresponded to a change in the intensity of coleoptile cell elongation. The effect was more visible in the Kuban 3 variety seedlings. However, regardless of the variety and amount of oxygen during germination, the content of vacuolar aquaporins TIP1 gradually increased. The obtained data indicate differences in the functional significance of aquaporins of the plasmalema membrane and tonoplast in the process of elongation growth of coleptile cells under normoxia and oxygen deficiency conditions.
Keywords: aquaporins, submergence, coleoptile, rice Oryza sativa L.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный |
Поступила в редакцию 12 декабря 2024 года
|
