doi: 10.15389/agrobiology.2024.2.328rus
УДК 636.2:619:575:579
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Свердловской области в рамках научного проекта № 20-416-660004 «Молекулярно-генетическая и фенотипическая характеристика микробиоты репродуктивной системы крупного рогатого скота».
ОСЕКВЕНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ V3-V4 ГЕНА 16S rRNA ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА И ВЗАИМОСВЯЗИ МИКРОБИОТЫ ПРИ ВОСПАЛЕНИИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА У КОРОВ (Bos taurus)
О.В. СОКОЛОВА✉, Н.А. БЕЗБОРОДОВА, М.В. БЫТОВ, В.Д. ЗУБАРЕВА, И.А. ШКУРАТОВА, О.С. ЗАЙЦЕВА, Н.А. МАРТЫНОВ
Воспалительные заболевания молочной железы и репродуктивного тракта крупного рогатого скота наносят наибольший экономический ущерб молочному животноводству. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA значительно расширило знание о бактериальных сообществах (микробиомах) и позволило выявить бактерии, о существовании которых ранее не было известно, поскольку их не удается культивировать in vitro. В представленной работе впервые показаны взаимосвязи между микробиотой репродуктивного тракта и молочной железы коров (Bostaurus) при развитии воспалительных заболеваний и выявлены новые этиологически значимые патогены. Нашей целью было определение состава микробиоты репродуктивного тракта и молочной железы коров при воспалении и сравнение полученных бактериальных профилей для обнаружения общей этиологии таких патологий. Для исследования на каждом из сельскохозяйственных предприятий, расположенных в пяти районах Свердловской области, сформировали 4 экспериментальных группы: 1-я — животные без признаков воспаления молочной железы и репродуктивного тракта (З); 2-я — животные с признаками воспаления молочной железы, но без признаков воспаления репродуктивного тракта (М); 3-я — животные с признаками воспаления репродуктивного тракта, но без признаков воспаления молочной железы (Э); 4-я — животные с признаками воспаления молочной железы и репродуктивного тракта (ЭМ). От каждой коровы в группах получали образцы биологического материала (секрет молочной железы, цервикальные смывы), который использовали для метагеномного анализа состава бактериальных сообществ. Анализ последовательностей вариабельных участков гена 16S rRNA показал, что подавляющее большинство идентифицированных операционных таксономических единиц (operational taxonomic units, ОТU) принадлежат домену Bacteria, остальные — филуму Euryarchaeota домена Archaea(0,38 % в пробах секрета молочной железы, 0,44 % — в цервикальных смывах). В образцах секрета молочной железы идентифицированы представители 19 бактериальных филумов, в том числе 43 класса, 85 порядков, 165 семейств и 484 рода. Половину бактериальных ОТU составлял филум Firmicutes(680 ОТU, 51,7 %), второй и третий по численности филумы — Actinobacteria и Bacteroidetes (соответственно 14,5 % и 11,3 %). В цервикальных смывах обнаружены представители 22 бактериальных филумов, в их числе 50 классов, 93 порядка, 172 семейства и 365 родов. Преобладающим бактериальным филумом оказался Firmicutes (876 ОТU, 55,3 %), вторым и третьим по численности — филумы Bacteroidetes и Actinobacteria(соответственно 13,3 % и 11,6 %). Секвенирование вариабельных участков гена 16S rRNA позволило установить наличие бактерий класса Clostridia и рода Facklamia, которые мы не обнаружили ранее, исследуя образцы с помощью культуральных методов. Этим подтверждается клиническое значение метагеномного секвенирования для уточнения состава этиологических агентов в случае некультивируемых или трудно культивируемых бактерий. Определена взаимосвязь микробиоты молочной железы и репродуктивного тракта при воспалительном процессе по относительному содержанию в секрете молочной железы и цервикальных смывах при воспалении, Turicibacter sanguinis, Staphylococcus aureus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus indolicus и Helcococcus ovis описаны как инфекционные агенты, провоцирующие воспалительный процесс. Полученные данные важны для углубленного понимание связи бактериальной этиологии и патогенеза при воспалительных заболеваниях молочной железы и репродуктивного тракта животных.
Ключевые слова: голштинская порода, 16S rRNA, микробиота, молочная железа, репродуктивный тракт.
O.V. Sokolova ✉, N.A. Bezborodova, M.V. Bytov, V.D. Zubareva,
I.A. Shkuratova, O.S. Zaitseva, N.A. Martynov
Inflammatory diseases of the mammary gland and reproductive tract of cattle cause the greatest economic damage to dairy industry. 16S rRNA gene sequencing has significantly expanded the knowledge of microbiomes and uncultured in vitro bacteria that were not previously known to exist. This paper aims to expand the understanding of the composition of the microbiota of the reproductive tract and mammary gland of cattle with the identification of non-culturable microorganisms. New etiologically significant pathogens were identified for the first time. The role of microbiota of these animal loci in the development of inflammatory diseases was established. Our goal was to determine the common bacterial etiology of the inflammatory process in the mammary gland and reproductive tract of cattle. 16S rRNA gene variable regions sequencing was carried out in order to compare the composition of microbiota in mammary gland and the reproductive tract of cattle with inflammation. Four experimental groups were formed from each farm in five districts of the Sverdlovsk Province, animals without signs of inflammation of the mammary gland and reproductive tract (NP, group 1); animals with inflammation of the mammary gland, but without inflammation of the reproductive tract (M, group 2); animals with inflammation of the reproductive tract, but without inflammation of the mammary gland (E, group 3); animals with inflammation of the mammary gland and reproductive tract (EM, group 4). Samples of biological material (mammary gland secretion, cervical swabs) were obtained from each cow of all experimental groups; 16S rRNA gene sequencing was used for further studies. Sequence analysis of the 16S rRNA variable regions showed that the vast majority of identified ОТU belong to the Bacteria domain, the rest belong to the Euryarchaeota type of the Archaea domain (0.38 % in mammary gland secretion samples, 0.44 % in cervical swabs samples). In mammary gland secretions, we reveled 19 bacterial types, including 43 classes, 85 orders, 165 families, and 484 genera. Half of the bacterial ОТU are the Firmicutes phylum (680 ОТU, 51.7 %), while Actinobacteria and Bacteroidetes are the second and third largest phyla (14.5 % and 11.3 %, respectively). Members of 22 bacterial phyla were found in cervical swabs, including 50 classes, 93 orders, 172 families and 365 genera. The predominant bacterial phylum is the Firmicutes phylum (876 ОТU, 55.3 %), the second and third largest phyla are the Bacteroidetes (13.3 %) and the Actinobacteria (11.6 %), respectively. By the 16S rRNA gene sequencing, we revealed bacteria of the class Clostridia and the genus Facklamia not detectable by cultural methods. This confirms clinical significance of the 16S rRNA gene sequencing method for clarifying etiological agents in the case of unculturable or difficult-to-culture bacteria. We revealed the interrelation between the microbiota of the mammary gland and the reproductive tract during inflammatory processes. The data contribute to a deeper understanding of the role of bacterial microbiota in the etiology and pathogenesis of inflammatory diseases of the mammary gland and the reproductive tract of animals.
Keywords: Holstein cattle, 16S rRNA, microbiota, mammary gland, reproductive tract.
ФГБНУ Уральский федеральный аграрный |
Поступила в редакцию |
