doi: 10.15389/agrobiology.2024.4.787rus
УДК 619:616.98:578.842.1:615.371
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАНДИДАТНОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА МК-200 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
М.Е. ВЛАСОВ, Д.А. КУДРЯШОВ, О.Л. КОЛБАСОВА, В.М. ЛЫСКА,
С.Ю. МОРГУНОВ, Е.Ю. ПИВОВА, М.С. ДЮМИН, И.П. СИНДРЯКОВА,
А.Д. СЕРЕДА ✉
Африканская чума свиней (АЧС, возбудитель — вирус африканской чумы свиней, African swine fever virus, ASFV, Asfarviridae, Asfivirus) — смертельная геморрагическая вирусная инфекция домашних свиней и евразийских диких кабанов (Sus scrofa). В зависимости от свойств изолятов/штаммов течение болезни может быть сверхострым, острым, подострым, хроническим и бессимптомным. Глобальная эпизоотия АЧС стимулировала работы по получению и изучению свойств кандидатных вакцинных штаммов, в первую очередь рекомбинантных и аттенуированных, рассматриваемых в качестве основы вакцин первого поколения. В настоящем исследовании впервые выявлены два цикла репликации вирусной ДНК в организме свиней, инокулированных кандидатным вакцинным штаммом МК-200 вируса АЧС: первый — на 17-21-е сут, второй — на 56-70-е сут после введения вируса. Цель работы — иммунобиологическая оценка кандидатного вакцинного штамма МК-200 вируса африканской чумы свиней по результатам наблюдения за клиническим состоянием животных, по содержанию вирусоспецифической ДНК и вирусоспецифических антител в пробах, полученных от свиней. Работу проводили в 2022 году в Федеральном исследовательском центре вирусологии и микробиологии (ФГБНУ ФИЦВиМ). Использовали клинически здоровых свиней (Sus domesticus) породы крупная белая 2-3-месячного возраста. Вирулентные штаммы вируса АЧС — Мозамбик-78 (IIIсероиммунотип, V генотип) и Ставрополь 01/08 (VIII сероиммунотип, II генотип) и аттенуированный штамм МК-200, полученный посредством селекции из штамма Мозамбик-78, с инфекционными титрами 107,0-108,0 ГАЕ50/мл были получены в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ. Приготовление первичной культуры клеток лейкоцитов свиней (ЛС) осуществляли в соответствии с ГОСТ 28573-90. Инфекционные титры вируса АЧС определяли в культуре клеток ЛС в реакции гемадсобции и рассчитывали по методу Б.А. Кербера в модификации И.П. Ашмарина. Схема эксперимента включала внутримышечную инокуляцию 10 свиньям вируса АЧС (штамм МК-200) в дозе 106,0 ГАЕ50 на 0-е сут. Образцы для исследования отбирали на 0-е, 3-и, 5-е, 7-е, 14-е, 17-е, 21-е, 28-е, 35-е, 42-е, 49-е, 56-е, 63-и, 70-е, 77-е сут после инъекции (с.п.и.). Температуру тела у экспериментальных животных измеряли ректально в течение всего срока наблюдения. Образцы крови получали пункцией яремной вены. Для получения образцов слюны свиней время для жевания прядей веревки (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) ограничивали 30 мин. Мокрые пряди веревок отжимали в чистые полиэтиленовые пакеты (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) и переливали собранную слюну в центрифужные пробирки («Thermo Fisher Scientific», США). Мазки с внутренней стороны щеки получали с помощью стерильного полиэфирного зонда-тампона с пластиковым аппликатором («МиниМед», Россия). Для выделения нуклеиновых кислот использовали систему ДНК MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit («Thermo Fisher Scientific», США). ПЦР-РВ проводили с использованием тест-системы IDEXX RealPCR ASFV DNA Mix («IDEXX», США). Для обнаружения антител к белкам вируса АЧС в сыворотке крови свиней применяли тест-систему ID Screen® African Swine Fever Competition («IDVet», Франция). Была установлена линейная зависимость между показателями Ct и инфекционными титрами в 10-кратных разведениях вирусосодержащих суспензий, полученных при заражении культуры клеток ЛС вирусом АЧС штаммов Мозамбик-78 или Ставрополь 01/08. Это позволило переводить данные, полученные при дальнейшем исследовании проб крови и ротовой полости в ПЦР-РВ, в значения инфекционных титров. Из 10 животных, которым инокулировали штамм МК-200, только у трех было зарегистрировано кратковременное (на 1-2 сут) повышение температуры тела выше физиологической нормы (40,1-40,6 °С) в период с 5-х по 7-е с.п.и. У остальных животных на протяжении первых 10 сут температура тела соответствовала показателям физиологической нормы. В период с 8-х по 77-е с.п.и. у всех свиней клинические признаки АЧС отсутствовали. В исследуемых образцах вирусную ДНК выявляли с 3-5-х сут с.п.и. Минимальные показатели (максимальное количество исследуемой матрицы) порогового цикла (Ct) при постановке ПЦР-РВ установлены в период с 17-21-х с.п.и., доля положительных проб в исследованных образцах достигала 60-100 %. Рассчитанные на основании линейной зависимости между инфекционными титрами вируса АЧС и показателями Ct значения виремии не превышали 104,0 ГАЕ50/мл в период с 0-х до 63-х с.п.и. и были ниже 101,9 ГАЕ50/мл с 70-х с.п.и. В течение эксперимента у животных наблюдали цикличную виремию и формирование возможности вирусовыделения через ротовую полость. Это указывает на риски горизонтальной и вертикальной передачи вакцинного штамма восприимчивым свиньям при прямом или непрямом контактах. Разработчикам кандидатных живых вакцин против АЧС рекомендовано предоставлять данные об исследовании виремии и вирусовыделения за период от 2,5 до 4 мес после прививки.
Ключевые слова: африканская чума свиней, кандидатные вакцины, иммунобиологическая оценка, ПЦР-РВ.
IMMUNOBIOLOGICAL EVALUATION OF THE CANDIDATE VACCINE STRAIN MK-200 OF THE AFRICAN SWINE FEVER VIRUS
M.E. Vlasov, D.A. Kudrjashov, O.L. Kolbasova, V.M. Lyska,
S.Yu. Morgunov, E.Yu. Pivova, M.S. Diumin, I.P. Sindryakova,
A.D. Sereda✉
African swine fever (ASF, causative agent African swine fever virus, ASFV) is a fatal hemorrhagic viral infection of domestic pigs and Eurasian wild boars (Sus scrofa). Depending on the properties of isolates/strains, the course of the disease can be peracute, acute, subacute, chronic, or asymptomatic. The global epizootic of ASF has stimulated the development and study of candidate vaccine strains, primarily recombinant or attenuated, considered as the basis for first-generation vaccines. In this study, two cycles of viral DNA replication were identified in pigs, inoculated with the ASFV candidate vaccine strain MK-200. The first cycle occurred on days 17-21, and the second on days 56-70 post-inoculation. The aim of the study was the evaluation of the immunobiological characteristics of the candidate ASFV vaccine strain MK-200 based on observations of the clinical condition, the presence of virus-specific DNA, and virus-specific antibodies in samples obtained from the pigs. The study was conducted in 2022 at the Federal Research Center for Virology and Microbiology (FRCVM). Clinically healthy large white breed pigs (Sus domesticus) aged 2-3 months were used. ASFV virulent strains Mozambique-78 (III seroimmunotype, V genotype) and Stavropol 01/08 (VIII seroimmunotype, II genotype) and the attenuated strain MK-200 obtained by selection from the Mozambique-78 strain, with infectious titers of 107.0-108.0 HAU50/ml were obtained from the state collection of microorganisms of FRCVM. The primary culture of pig leukocyte cells (LC) was prepared according to GOST 28573-90. ASFV infectious titers were determined in LC cultures by hemadsorption assay and calculated by the method of B.A. Kerber and I.P. Ashmarin. The experimental design included intramuscular inoculation of 10 pigs with ASFV (strain MK-200) at a dose of 106.0 HAU50 on day 0. Samples for study were collected on days 0, 3, 5, 7, 14, 17, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, and 77 post-infection (p.i.). The body temperature of the experimental animals was measured rectally throughout the all observation period. Blood samples were collected by puncturing the jugular vein. To obtain saliva samples, pigs were given strands of rope to chew (LLC TD PROMT, Russia) for 30 min. The wet rope strands were squeezed into clean polyethylene bags (LLC TD PROMT, Russia), and the collected saliva was transferred to centrifuge tubes (Thermo Fisher Scientific, USA). Cheek swabs were collected using sterile polyester swabs with plastic applicators (MiniMed, Russia). The MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) was used to extract nucleic acids. Real-time PCR (qPCR) was performed using the IDEXX RealPCR ASFV DNA Mix test system (IDEXX, USA). To detect antibodies to ASFV proteins in pig serum, the ID Screen® African Swine Fever Competition test system (IDVet, France) was used. We revealed a linear relationship between Ct values and infectious titers in 10-fold dilutions of virus-containing suspensions obtained by infecting LC cultures with ASFV strains Mozambique-78 or Stavropol 01/08. This allowed the conversion of data obtained from further blood and oral cavity sample studies in qPCR into infectious titer values. Of the 10 animals inoculated with the MK-200 strain, only three showed a brief (1-2 days) increase in body temperature above the physiological norm (40.1-40.6 °С) between days 5 and 7 p.i. The body temperature of all remained animals was within physiological norms during the first 10 days. From days 8 to 77 p.i., in all animals no clinical signs of ASF were observed. Viral DNA was detected in the samples from days 3-5 p.i. The minimum Ct values (maximum amount of target matrix) in qPCR were observed from days 17-21 p.i., with the proportion of positive samples reaching 60-100 %. Calculated viremia values based on the linear relationship between ASFV infectious titers and Ct values did not exceed 104.0 HAU50/ml from days 0 to 63 p.i. and were below 101.9 HAU50/ml from day 70 p.i. Throughout the experiment, cyclic viremia and the potential for virus shedding through the oral cavity were observed. This indicates the risks of horizontal and vertical transmission of the vaccine strain to susceptible animals through direct or indirect contact. We recommend to the developers of candidate live vaccines against ASF to provide data on viremia and virus shedding studies for a period of 2.5 to 4 months post-vaccination.
Keywords: African swine fever, candidate vaccines, immunobiological evaluation, Real-time PCR.
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр |
Поступила в редакцию |
