doi: 10.15389/agrobiology.2024.4.692rus
УДК 636.32/.38:591.39:576.5
Исследования выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ по теме FGGN-2024-0014 (номер государственной регистрации 124020200127-7).
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ПОДГОТОВКИ ООЦИТОВ И ДОНОРСКИХ КЛЕТОК НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОМАТИЧЕСКОГО КЛОНИРОВАНИЯ У ДОМАШНЕЙ ОВЦЫ (Ovis aries L.)
Г.Н. СИНГИНА ✉, А.В. ЛОПУХОВ, Е.Н. ШЕДОВА, А.С. ЖУКОВА
Технология получения эмбрионов методом клонирования ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) может быть применена в овцеводстве для решения задач по размножению и сохранению ценных животных, а также созданию новых генотипов методами геномного редактирования. Вместе с тем эффективность SCNT у Ovis aries остается сравнительно низкой и существует необходимость в оптимизации ее отдельных этапов. В представленной работе была поставлена цель оценить результативность технологии SCNT в зависимости от применяемой среды in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) ооцитов, их возраста на момент начала процедуры энуклеации и переноса соматической клетки (СК) в перивителлиновое пространство полученных цитопластов (nuclear transfer, NT), а также условий подготовки СК — продолжительности их сывороточного голодания (СГ) в культуре и длительности хранения в суспензии накануне NT. Изучали воздействие перечисленных факторов на образование цитогибридов в процессе слияния энуклеированного ооцита и СК (доля слияния), а также на развитие клонированных эмбрионов (доля дробления цитогибридов). Выделенные post mortem ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) созревали в ТС-199 или в среде BO-IVM от «IVF Bioscience» (Великобритания). Для NT использовали ооциты с первым полярным тельцем (ППТ) в возрасте от 20 до 23 ч (с момента начала IVM), а также фетальные фибробласты (ФФБ) в качестве донорских СК. Последние накануне культивировали до 80-100 % монослоя с последующей инкубацией в условиях СГ (для синхронизации клеточного цикла) в течение 24 или 48 ч. К процедуре переноса в энуклеированный ооцит готовили суспензию ФФБ, которую хранили до NT на протяжении различных периодов времени (≤ 30, 31-90, 91-150 и > 151 мин). Полученные в результате NT-реконструирования клеточные комплексы подергали процедуре электрослияния, образовавшиеся цитогибриды активировали, после чего культивировали в течение 2 сут для эмбрионального развития. Доля слияния значимо не различалась между экспериментальными группами и варьировалась от 31 до 42 %. Также не различалась доля дробления цитогибридов, если созревание ооцитов происходило в среде ТС-199 или BO-IVM (соответственно 47,1±2,40 % и 50,9±3,30 %). Когда для процедуры NT использовали ооциты с ППТ в возрасте 22 ч, выход клонированных эмбрионов составил 55,8±3,78 %. Для более ранних ооцитов результат был сопоставимым, а более возрастные (23 ч) показали его существенное ухудшение (до 39,3±6,69 %, p < 0,05). К повышению доли раздробившихся цитогибридов также приводило удлинение периода СГ культуры ФФБ с 24 до 48 ч (45,0±4,21 против 55,4±4,50, p < 0,05). Продолжительность хранения ФФБ в суспензии значимо не повлияла на долю дробления цитогибридов, но ее наибольшее значение (56,6 %) было при использовании ФФБ, хранившихся от 31 до 90 мин, а наименьшее — когда время превышало 150 мин (40,8 %). Таким образом, впервые показано, что эффективность получения SCNT-эмбрионов ранних стадий развития у O. aries зависит от возраста ооцитов на момент начала процедуры NT и продолжительности СГ культуры ФФБ накануне NT, оптимальные параметры которых (применительно к описанному нами протоколу) — соответственно 20-22 ч и 48 ч, а также то, что для IVM ооцитов овец в SCNT может быть использована среда BO-IVM фирмы «IVF Bioscience». Выявленные закономерности можно в целом считать предварительными, так как тестируемые факторы, возможно, обладают более долгосрочными эффектами (в частности, в отношении развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты и их качества), при изучении которых между исследованными вариантами могут проявится более значимые различия.
Ключевые слова: Ovis aries, домашняя овца, клонирование, ооциты, созревание in vitro, соматические клетки, сывороточное голодание, эмбриональное развитие.
G.N. Singina ✉, A.V. Lopukhov, E.N. Shedova, A.S. Zhukova
Obtaining embryos through somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a reproductive biotechnology that can be applied in sheep farming to address issues related to the reproduction and preservation of valuable animals, as well as the creation of new genotypes through genome editing methods. However, the efficiency of cloning technology in Ovis aries remains comparatively low, necessitating the optimization of its various stages. In this context, the objective of this study was to assess the efficiency of SCNT based on the in vitro maturation (IVM) environment of oocytes, their age at the time of nuclear transfer (NT, procedure which includes enucleation of oocytes followed by transfer somatic cell into the perivitelline space of the obtained cytoplasts), as well as the preparation conditions of the somatic cells (duration of serum starvation in culture and storage time in suspension before NT). The impact of these factors on the formation of cytohybrids during the fusion of enucleated oocytes and somatic cells (fusion rate), as well as on the development of cloned embryos (cleavage rate of cytohybrids), was studied. Post mortem cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in TC-199 or in BO-IVM medium from IVF Bioscience (United Kingdom). Oocytes with the first polar body (PB1), aged between 20 to 23 hours (from the start of IVM), were used for NT, along with fetal fibroblasts (FFBs) as donor somatic cells. The latter were cultured to 80-100 % confluence, followed by incubation under serum starvation conditions (to synchronize the cell cycle) for 24 or 48 hours. FFBs were prepared for transfer into the enucleated oocyte in suspension, stored until NT for various durations: ≤ 30, 31-90, 91-150, and > 151 minutes. The cell complexes resulting from NT reconstruction underwent electrofusion, obtained cytohybrids were activated, and then cultured for 2 days for embryonic development. The fusion rate did not significantly differ between experimental groups, ranging from 31 to 42 %. The cleavage rate of cytohybrids also did not differ when oocyte maturation occurred in TCM-199 or BO-IVM medium (47.1±2.40 % and 50.9±3.30 %, respectively). When NT was performed using 22-hour-old oocytes, the yield of cloned embryos was 55.8±3.78 %. Earlier-stage oocytes showed comparable results, while older oocytes (23 hours) significantly reduced the yield (to 39.3±6.69 %, p < 0.05). Extending the serum starvation period of FFBs from 24 to 48 hours also increased the cytohybrid cleavage rate (45.0±4.21 vs. 55.4±4.50, p < 0.05). The duration of FFBs storage did not significantly affect the cleavage rate, but the highest value (56.6 %) was observed with FFBs stored for 31 to 90 minutes, and the lowest when storage time exceeded 150 minutes (40.8 %). Thus, the efficiency of obtaining early-stage cloned embryos in O. aries depends on the age of the oocytes at the time of NT and the duration of FFBs serum starvation before NT. The optimal parameters for the described protocol are 20-22 hours and 48 hours, respectively. Additionally, BO-IVM medium can be used for the maturation of source oocytes when producing cloned sheep embryos. Overall, the identified patterns can be considered preliminary, as the tested factors may have longer-term effects (particularly on the development of cloned embryos to the blastocyst stage and their quality), where more significant differences between the studied variants may become apparent.
Keywords: domestic sheep, cloning, oocytes, in vitro maturation, somatic cells, serum starvation, embryonic development.
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, |
Поступила в редакцию |
