doi: 10.15389/agrobiology.2024.4.680rus
УДК 639.3:597.4/.5:575.22
Для проведения исследований использовали оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ (грант № 21-66-00007).
АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ SNP (400 С > А) В ГЕНЕ IGF1
С ПОКАЗАТЕЛЯМИ РАЗМЕРА И МАССЫ У СТЕРЛЯДИ
(Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758)
Н.Б. ПИСАРЕНКО ✉, Н.В. БАРДУКОВ, В.И. НИКИПЕЛОВ,
А.К. НИКИПЕЛОВА, В.Р. ХАРЗИНОВА, Н.А. ЗИНОВЬЕВА
Стерлядь (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) относиться к видам осетровых рыб, представляющих интерес для выращивания в аквакультуре, поскольку характеризуется ранним половым созреванием и хорошо адаптируется к условиям содержания. В связи с развитием товарной аквакультуры возрастает спрос на разведение стерляди, имеющей высокую скорость роста, что обеспечивает наибольший экономический эффект. Для генетического улучшения популяций аквакультурной стерляди по этому экономически значимому признаку важно идентифицировать полиморфизмы, значимо связанные с особенностями роста рыбы. Удобный и эффективный подход к выявлению молекулярных маркеров, влияющих на полигенные признаки, — изучение ассоциаций между полиморфизмами в генах-кандидатах и показателями продуктивности. Известно, что инсулиноподобный фактор роста 1 (insulin-like growth factor 1, IGF1) играет важную роль в росте и развитии позвоночных. В представленной работе мы впервые секвенировали последовательности кДНК паралогичных генов инсулиноподобного фактора роста 1 стерляди и выявили на 7-й хромосоме несинонимичный полиморфизм (400 С > А) в 1-м экзоне и синонимичный SNP (479 С > А) — во 2-м экзоне. Также получены данные о влиянии генотипа по SNP (400 С > А) гена IGF1 на размеры и массу стерляди. Нашей целью было изучение полиморфизма кодирующей части гена IGF1 с помощью секвенирования кДНК, идентификация SNP и проведение ассоциативных исследований генотипов по размерно-весовыми показателями стерляди. Исследования проводили на сухонской (n = 58) и окской (n = 44) популяциях стерляди, содержащихся в установке замкнутого водоснабжения (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год). Окская популяция стерляди была привезена с Можайского производственно-экспериментального рыбоводного завода (Можайский городской округ, Московская обл.), сухонская — получена в ООО РТФ «Диана» (Кадуйский р-н, Вологодская обл.). Было выполнено чипирование рыбы и создана база данных, в которую заносили результаты бонитировки. Измерения проводили по 11 морфометрическим признакам. Тотальную РНК выделяли из фрагментов печени, мозга, мышцы, сердца и из крови с помощью комплекта реагентов РНК-ЭКСТРАН (НПО «Синтол», Россия). Синтез первой цепи ДНК на РНК-матрице проводили с использованием набора реагентов для проведения обратной транскрипции (НПО «Синтол», Россия). Геномную ДНК экстрагировали из консервированных в спирте фрагментов плавников с использованием набора для выделения геномной ДНК ДНК-ЭКСТРАН (НПО «Синтол», Россия). ПЦР выполняли на амплификаторе Thermal Cycler SimpliAmp («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Детекцию результатов ПЦР осуществляли в 1-2 % агарозном геле с использованием колориметрической системы гель-документирования Uvitec FireReader V10 imaging System («Cleaver Scientific», Великобритания). A. ruthenus относится к тетраплоидным видам, поэтому подбор специфичных праймеров проводили к двум паралогичным генам, локализованным на 7-й и 14-й хромосомах. Последовательности ДНК определяли методом секвенирования по Сэнгеру на генетическом анализаторе Нанофор 05 (НПО «Синтол», Россия) с использованием набора GenSeq (НПО «Синтол», Россия) согласно инструкциям производителя. Полиморфизм гена (С ® A в позиции 400 Accession No. XM_034024781.3) определяли методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США). Работу с полученными нуклеотидными последовательностями генов выполняли с помощью специального программного обеспечения Mega7. В результате множественного выравнивания были идентифицированы несинонимичный (400 С > А) и синонимичный (479 G > A) однонуклеотидные полиморфизмы (7-я хромосома). Несинонимичная мутация в позиции 400 С > А приводила к замене аминокислоты пролина (триплет ССТ) на гистидин (триплет САТ) и, как следствие, к изменению пространственной структуры белка и его функций. Ассоциативные исследования генотипов по локусу 400С > Ас размерами и массой стерляди показали, что рыбы с генотипом СС имели достоверно большую массу тела, общую длину, длину тела до конца средних лучей, пектровентральное расстояние и наибольший обхват тела (р < 0,05), чем гетерозиготы АС. Дисперсионный анализ выявил достоверное влияние генотипа по SNP 400С > Ана общую длину стерляди (р < 0,05). Результаты исследований позволяют предположить, что полиморфизм 400 С > А гена IGF1 можно рассматривать как потенциальный генетический маркер для отбора по показателям роста у стерляди. Однако мы считаем необходимым провести дополнительные ассоциативные исследования на более многочисленной популяции, а также изучить влияние комплексных генотипов на показатели роста.
Ключевые слова: IGF1, Acipenserruthenus, стерлядь, полиморфизм, SNP, размерно-весовые показатели.
N.B. Pisarenko ✉, N.V. Bardukov, V.I. Nikipelov, A.K. Nikipelova,
V.R. Kharzinova, N.A. Zinovieva
Sterlet (Acipenser ruthenus,Linnaeus, 1758) is an important species of sturgeon bred in aquaculture, since it is characterized by early sexual maturity and adapts well to the conditions of maintenance. In commercial aquaculture, the demand for breeding sterlet which has a high growth rate is increasing to obtain the greatest economic effect. The study of associations between polymorphisms in candidate genes and productivity indicators is a convenient and effective approach to identify molecular markers that affect polygenic traits. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) plays an important role in the growth and development of vertebrates, so the identification of polymorphisms significantly associated with growth characteristics may be useful in genetic improvement of aquaculture sterlet populations. In the present work, we sequenced cDNA of paralogous insulin-like growth factor 1 genes of sterlet for the first time and identified a non-synonymous polymorphism 400 C > A in exon 1 and a synonymous SNP 479 C > A in exon 2 on chromosome 7, and also investigated the effect of the genotype for SNP 400 C > A of the IGF1 gene on the size and weight indicators of sterlet. Our goal was to study the polymorphism of the coding part of the IGF1 gene by cDNA sequencing, identify SNPs and evaluate associations between genotypes and size-weight indicators of sterlet. The studies were conducted in 2023 on the Sukhonskaya (n = 58) and Oka (n = 44) sterlet populations bred in the recirculating aquaculture system (the Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry). The Oka sterlet population of was provided by the Mozhaisk production and experimental fish hatchery (Mozhaisk urban District, Moscow Province), the Sukhon sterlet population by OOO RTF Diana (Kaduysky district, Vologda Province). The fish were chipped and a database was created to enter the grading results. Measurements were made for 11 morphometric features. Total RNA was isolated from fragments of the liver, brain, muscle, heart and blood using the RNA-EKSTRAN reagent kit (NPO Sintol, Russia). The synthesis of the first DNA strand on the RNA matrix was performed using a reagent kit for reverse transcription (NPO Sintol, Russia). Genomic DNA was extracted from fin fragments preserved in alcohol using the DNA-EKSTRAN genomic DNA isolation kit (NPO Sintol, Russia). PCR was performed on a Thermal Cycler SimpliAmp amplifier (Thermo Fisher Scientific, Inc, USA). Detection of PCR results was performed in 1-2 % agarose gel using the Uvitec FireReader V10 imaging system (Cleaver Scientific, UK). Acipenser ruthenus belongs to tetraploid species, therefore, specific primers were selected for two paralogous genes localized on chromosomes 7 and 14. DNA sequences were determined by Sanger sequencing on a Nanofor 05 genetic analyzer (NPO Sintol, Russia) with the GenSeq kit (NPO Sintol, Russia) according to the manufacturer's instructions. Gene polymorphism (C > A at position 400 Accession No. XM_034024781.3) was determined by real-time PCR (RT-PCR) on a QuantStudio 5 device (Thermo Fisher Scientific, USA). The obtained nucleotide sequences of genes was processed using special Mega7 software. After multiple alignment, non-synonymous (400 C > A) and synonymous (479 G > A) single nucleotide polymorphisms (chromosome 7) were identified. Non-synonymous mutation at position 400 C > A resulted in the replacement of the amino acid proline (CCT triplet) by histidine (CAT triplet) and, as a consequence, in a change in the spatial structure of the protein and its functions. Association studies of genotypes for the 400 C > A locus with the size and weight characteristics of sterlet showed that fish with the CC genotype had a significantly larger body weight, total length, body length to the end of the middle rays, pectroventral distance and the largest body girth (p < 0.05) than AC heterozygotes. Analysis of variance revealed a reliable effect of the genotype for the 400 C > A SNP on the total length of sterlet (p < 0.05). The results of the studies suggest that the 400 C > A polymorphism of the IGF1 gene can be considered as a potential genetic marker in sterlet selection for growth parameters. However, we believe it is necessary to conduct additional association studies on a larger population, as well as to study the influence of complex genotypes on growth indicators.
Keywords: IGF1 gene, Acipenser ruthenus, sterlet, polymorphism, SNP, size and weight parameters.
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, |
Поступила в редакцию |
