doi: 10.15389/agrobiology.2024.4.799rus
УДК 619:578
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА Salmonella phage BF-1356
И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ ФАГОТЕРАПИИ ПУЛЛОРОЗА КУР
А.И. ЛАИШЕВЦЕВ1, 2 ✉, Э.Р. ЗУЛЬКАРНЕЕВ3, Н.В. ПИМЕНОВ4,
И.А. КИСЕЛЕВА5, К.М. БАГАНДОВА5, Т.Э. МИЗАЕВА5, А.В. АЛЕШКИН5
Salmonella Pullorum — редко встречающийся, но важный патоген из рода Salmonella, который наносит серьезный вред птицеводству и вызывает экономические потери, связанные с высокой летальностью птицы. Терапия бактериофагами активно обсуждается в последнее время как дополнительный метод лечения птицы. В представленной работе была впервые показана терапевтическая эффективность вирулентного бактериофага Salmonella phage BF-1356, назначенного спустя 12 ч после перорального заражения цыплят кросса Cobb 500 высоковирулентным штаммом Salmonella Pullorum № 732-ВИЭВ. Цель работы — характеристика бактериофага Salmonella phage BF-1356 и его взаимодействия с бактериальным штаммом-хозяином in vitro, а также оценки эффективности фаготерапии пуллороза in vivo на модели цыплят Cobb 500. Штамм сальмонеллы (Salmonella Pullorum № 732-ВИЭВ) был выделен в 2017 году на птицефабрике в Московской области. Для проведения фаготерапии использовали вирулентный бактериофаг Salmonella phage BF-1356 из коллекции Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (Россия). Очищенный бактериофаг содержал титр не менее 1011 БОЕ/мл. Стерильность готового фага проверяли посредством инкубации 0,1 мл фаголизата в 5 мл тиогликолевой среды («HiMedia», Индия) при 32,5±2,5 и 22,5±2,5 °С в течение 14 сут. Диапазон литической активности бактериофага определяли в отношении 164 бактериальных штаммов Salmonella enterica, выделенных на территории РФ в 2010-2018 годы. Литическую активность оценивали визуально по появлению зоны лизиса в точках нанесения бактериофага на индикаторные чашки Петри с 1,5 % агаром Мюллера-Хинтона, которые содержали 200 мкл культуры исследуемых штаммов в середине лог-фазы (106 КОЕ). Оценивали адсорбцию бактериофага Salmonella phage BF-1356 на штамме Salmonella Typhimurium B-1025. Латентный период и выход Salmonella phage BF-1356 определяли посредством мониторинга динамических изменений числа фаговых частиц в течение репликативного цикла на штамме Salmonella Typhimurium B-1025. Чтобы оценить влияние pH на титр бактериофагов, известные концентрации очищенных бактериофагов инкубировали в буферах при различных значениях pH. В качестве лабораторных объектов использовали не зараженных сальмонеллами 14-суточных цыплят (Gallus gallus L.) кросса Cobb 500 (n = 40). Цыплят случайным образом разделили на группы: 10 цыплят использовали для контроля условий содержания (I контрольная группа не подвергалась заражению и фаготерапии), 20 цыплят — для определения эффективности препарата после его лечебного использования и оценки дальнейшего сальмонеллоносительства (опытная группа); 10 цыплят — как контроль заражения (II контрольная группа, инфицированная сальмонеллой, без введения бактериофага). Птицу опытной и II контрольной группы в возрасте 14 сут подвергали пероральному заражению Salmonella Рullorum № 732-ВИЭВ в дозе 3,8×108 кл., в объеме, равном 0,4 мл, что соответствовало ~ 5 LD50 (острой инфицирующей дозе, гарантирующей моделирование инфекции пуллороза с полной гибелью в контрольной группе). Критерием для начала применения бактериофага служило появление симптомов инфекционного процесса. Цыплятам из опытной группы вводили бактериофаг перорально в дозе 1010 БОЕ/мл, в объеме 0,2 мл. Исследование на наличие фагов и сальмонелл у птицы проводили сразу после дефекации. Число фаговых частиц оценивали методом двойных агаровых слоев. Для подтверждения эффективности фаготерапии птицу из опытной группы подвергали убою, проводили патологоанатомическое вскрытие и отбор секционного материала для лабораторных исследований и идентификации культур сальмонелл из органов. В контрольной группе патологоанатомическое вскрытие проводили по мере падежа птицы. Бактериофаг Salmonella phage BF-1356 проявлял специфическую литическую активность в отношении распространенных сероваров сальмонелл, таких как Pullorum, Enteritidis, Typhimurium, Cholerasuis, Infantis. Латентный период для бактериофага составлял в среднем 40 мин, а среднее число высвободившихся фагов из одной клетки-мишени — 67 вирусных частиц. Бактериофаг был стабилен при pH 5-8 и незначительно снижался в титре при pH 3,6 в течение 1 ч. Однократное пероральное введение бактериофага BF-1356 в титре 1010 БОЕ/мл через 12 ч после заражения цыплят кросса Cobb 500 штаммом Salmonella Pullorum № 732 позволило обеспечить 100 % сохранность поголовья и значительно снизить последствия патологического процесса у цыплят. Гибель цыплят контрольной группы происходила в течении 2-6 сут. Структура поражений была свойственна для сальмонеллезной патологии, что подтвердилось в лабораторных условиях. Полной элиминации возбудителя из организма не было достигнуто, однако при инфицировании 5 LD50 отмечали эффективное снижение выделения возбудителя из органов и тканей уже на 7-е сут. Таким образом, терапевтическая эффективность прототипа средства на основе штамма Salmonella phage BF-1356 в отношении цыплят кросса Cobb 500 составила 100 %, микробиологи-ческая эффективность — 75-80 %. Полученные данные позволяют сделать вывод о перспективах создания лечебно-профилактического средства для птицеводства на основе изученного штамма пуллорного бактериофага и его применения в противоэпизоотической работе.
Ключевые слова: пуллороз, вирулентные бактериофаги, адсорбция, спектр литической активности, испытания in vivo, сальмонеллез, генерализованная форма.
A.I. Laishevtsev1, 2 ✉, E.R. Zulkarneev3, N.V. Pimenov4, I.A. Kiseleva5, K.M. Bagandova5, T.E. Mizaeva5, A.V. Aleshkin5
Salmonella Pullorum is a rare but significant pathogen of the genus Salmonella, respon-sible for considerable damage to the poultry industry and economic losses due to high poultry mortality. The potential use of bacteriophage therapy as an adjunctive treatment for poultry has been the subject of considerable debate in recent times. This study demonstrates, for the first time, the therapeutic efficacy of virulent bacteriophage Salmonella phage BF-1356 administered 12 hours after oral infection of cross Cobb 500 chickens (Gallus gallus L.) with a highly virulent strain Salmonella Pullorum № 732-VIEV. The objective of this study was twofold: firstly, to characterize Salmonella phage BF-1356 and its interaction with the host bacterial strain in vitro; sec-ondly, to evaluate the efficacy of phage therapy for pullorosis in vivo on the Cobb 500 chicken model. Salmonella strain (Salmonella Pullorum № 732-VIEV) was isolated in 2017 at a poultry farm in the Moscow region. The virulent bacteriophage Salmonella phage BF-1356 from the collection of the Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology (Moscow, Russia), was used for phage therapy. The purified bacteriophage exhibited a titer of at least 1011 PFU/ml. The sterility of the phage preparation was verified through the incubation of 0.1 ml of phage lysate in 5 ml of fluid thioglycollate medium (HiMedia, India) at 32.5±2.5 and 22.5±2.5 C for 14 days. The host range of bacteriophage lytic activity was determined using 164 bacterial strains of Salmonella enterica isolated in the Russian Federation between 2010 and 2018. The lytic activity was evaluated visually by a lysis zone at the points of bacteriophage application on indicator Petri dishes with 1.5 % Mueller-Hinton agar which contained 200 µl of a mid-log-phase culture of the tested strains (106 CFU). The adsorption of Salmonella phage BF-1356 on Salmonella Typhimurium strain B-1025 was evaluated. The latent period and burst size of Salmonella phage BF-1356 were determined by monitoring the dynamic changes in the number of phage particles during the replicative cycle on Salmonella Typhimurium B-1025. In order to evaluate the effect of pH on bacteriophage titer, known concentrations of purified bacteriophages were incubated in buffers at different pH values. Salmonella-free 14-day-old chickens of cross Cobb 500 (n = 40) were used as laboratory objects. The chickens were randomly divided into three groups. Ten chickens were used to control housing conditions (I control group not exposed to infection and phage therapy), 20 chickens were used to determine the efficacy of the phage after its use for therapeu-tic purposes and to assess further Salmonella carriage (experimental group), and 10 chickens were used as infection control (II control group infected with Salmonella without bacteriophage ad-ministration). The 14 day-old chicks in the experimental and II control groups were orally infected with Salmonella Pullorum № 732-VIEV at a dose of 3.8×108 cells in 0.4 ml which corresponded to approximately 5 LD50 (the acute infectious dose that guaranteed the modelling of pullorosis infection with the complete death of control group subjects). The administration of bacteriophage was initiated upon the onset of symptoms indicative of the infectious process. The chicks in the experimental group were administered bacteriophage orally at a dose of 1010 PFU/ml in 0.2 ml. The presence of phages and Salmonella cells was promptly identified following the act of defecation. The quantity of phage particles was subsequently determined by the double-layer agar method. To confirm the efficacy of phage therapy, the birds in the experimental group were slaughtered for pathological and anatomical autopsy and collection of sectional material for laboratory studies and the identification of Salmonella cultures from organs. In the control group, patholog-ical autopsy were conducted as the birds died. Salmonella phage BF-1356 demonstrated specific lytic activity against common Salmonella serovars, including Pullorum, Enteritidis, Typhimurium, Cholerasuis and Infantis. The mean latent period for bacteriophage was 40 minutes, with an aver-age of 67 viral particles released per cell. The bacteriophage demonstrated stability at pH levels between 5 and 8, with a slight decrease in titer observed at pH 3.6 within the first hour. A single oral administration of bacteriophage BF-1356 in a titer of 1010 PFU/ml 12 hours after infection of Cobb 500 chickens with Salmonella Pullorum strain № 732 resulted in 0 % mortality in the population and a significant reduction in the consequences of the pathological process in the chickens after phage therapy. The chickens in the control group exhibited mortality within a period of 2-6 days. The structure of the pathological lesions was consistent with that observed in salmonellosis, a diagnosis that was subsequently confirmed in laboratory conditions. Despite the absence of a complete elimination of the pathogen from the organism, a notable reduction in the isolation of the pathogen from organs and tissues occurred on day 7, particularly under the infection with 5 LD50. Therefore, the prototype agent based on Salmonella phage BF-1356 demonstrated 100 % therapeutic efficacy and 75-80 % microbiological efficacy. The data obtained indicate the potential of the studied bacteriophage strain for the creation of therapeutic and prophylactic means against pullorosis to be used in poultry farming and in the epizootic control.
Keywords: pullorosis, virulent bacteriophages, adsorption, spectrum of lytic activity, in vivo tests, salmonellosis, generalized form.
1ООО «ЦБО Микроэкологии»,143026 Россия, г. Москва, территория Инновационного центра «Сколково», Большой бульвар, 42, корп. 1, эт/пом/раб 0/157/5,е-mail: a-laishevtsev@bk.ru ✉; |
Поступила в редакцию |
