doi: 10.15389/agrobiology.2024.4.814rus
УДК 619:579.62:615.37
Исследования выполнялись в рамках работ по государственному заданию Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (НГАУ № 123121500008-1 и ИХБФМ СО РАН № 121031300043-8).
ИММУНОГЕННОСТЬ И ИНВАЗИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
РОДА Bacillus ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ
Н.А. ДОНЧЕНКО1, 2, Ю.Н. КОЗЛОВА3, В.Ю. КОПТЕВ1, 2, Ф. ЯН4,
Ю.С. ХОМЕНКО1, Е.В. НЕФЕДОВА1, В.Н. АФОНЮШКИН1, 2, 3 ✉,
О.В. МИШУКОВА3, Л.П. ЕРМАКОВА2, К.В. АН1, 4, Я.В. НОВИК2
Иммуномодулирующие эффекты пробиотиков на основе микроорганизмов рода Bacillus связаны с их способностью к проникновению через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровеносную систему. Представляется перспективным создание рекомбинантных вакцин на основе микроорганизмов рода Bacillus, продуцирующих рекомбинантные антигены наиболее значимых и антигенно изменчивых вирусных и бактериальных агентов сельскохозяйственной птицы, свиней и крупного рогатого скота. Проблема пероральной вакцинации заключается в развитии пищевой иммунотолерантности, связанной с вовлечением в реакции адаптивного иммунитета CD4+ и CD8+/Treg лимфоцитов, подавляющих иммунный ответ в отношении вводимого антигена. В настоящей работе впервые показано, что наличие инвазивности у микроорганизмов родов Bacillus и Geobacillus служит важным, но не единственным фактором, определяющим их иммуногенность. Мы установили, что, помимо B. subtillis, в качестве средства доставки рекомбинантных антигенов можно рассматривать B. atrophaeus. Нашей целью был поиск штаммов рода Bacillus,обладающих оптимальной инвазивностью и иммуногенностью, как пероральных средств доставки рекомбинантных антигенов с эффектом преодоления пищевой иммунотолерантности. Культуры микроорганизмов рода Bacillus были предоставлены Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) (22 культуры) и ООО «СибАФ» (г. Бердск) (7 культур). Идентификацию культур проводили методом секвенирования 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру. Штаммы высевали на 3 % триптиказо-соевой бульон (TSB), 0,5 % дрожжевой экстракт (YE) и 1,5 % агар Bacto («BD Biosciences», США), после чего инкубировали при 37 °C в течение 16 ч. Бактериальные клетки инактивировали прогреванием при 65 °С в течение 3 ч и добавлением фурацилина до концентрации 0,1 %. Культуры 29 штаммов тестировали на иммуногенность in vivoна мышах-гибридахF1 (A/Sn × Balb/C). Животным выпаивали перорально через зонд по 200 мкл культуральной жидкости микроорганизмов родовBacillusиGeobacillusв концентрации 0,7 ед. McF, 3-кратно с интервалом 7 сут. Через 3 нед брали кровь для серологических исследований. Показатели иммуногенности и инвазивности оценивали в реакции агглютинации с флуоресцентно меченными О-антигенами. Реакцию агглютинации проводили с сыворотками крови мышей. Инвазивность при пероральном введении культур рода Bacillus оценивали посредством постановки биопробы на 10-суточных цыплятах (Gallus gallus L.) кросса Shaver. Ежесуточно в течение 10 сут цыплятам вводили 1-суточную культуру исследуемого микроорганизма в дозе 200 мкл орально (1 млрд КОЕ/мл). На 11-е сут проводили убой и делали посевы биоматериала (мышцы, печень и сердце) на мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. Также анализировали инвазивность микроорганизмов рода Bacillus на мышах линии С57Black. Животным вводили орально по 100 мкл культуры микроорганизма 1 раз в сутки в течение 2 сут подряд. На 3-и сут проводили убой и делали посевы материала печени и сердца на Eugonic агар, мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. При проведении теста на наличие биосурфактантной активности Oil spreading assay культуральную жидкость разводили дистиллированной водой и вносили 20 мкл нефти. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду, в качестве позитивного контроля — SDS (sodium dodecyl sulfate, 1 % v/v). Разрушение нефтяного пятна учитывали как положительный результат. Только 27,5 % культур микроорганизмов рода Bacillus инициировали образование антител к собственным корпускулярным антигенам при пероральном введении мышам F1 (A/Sn × Balb/C). Среди изученных культур B. subtilis образование антител вызывали 71,42 %. Образование антител также стимулировали культуры других видов: B. atrophaeus B8, изолят B23 B. zhangzhoulensis (по другим источникам отнесен к B. pumilus или B. safensis),штамм B. licheniformis В10. Большинство микроорганизмов рода Bacillus не стимулировали продукцию антител к собственным антигенам. Культуры B. mucoides/B. weihenstephanensis B31, B. simplex B32, B. thuringiensis B20, B. subtillis, B. amyloliquefaciens 2-15, Bacillus spp.1’-37-7 оказывали патогенное действие, сопровождавшееся гибелью мышей при пероральном введении: погибало от 25 до 50 % особей. При пероральном введении культур рода Bacillus птице у всех опытных кур грудные и бедренные мышцы были контаминированы на 100 %, печень и сердце — соответственно на 96 и 52 %. Инвазивность для мышей характеризовалась выявлением микроорганизмов в образцах печени и сердца через 18 ч после последнего перорального введения. Устойчивой инвазивностью обладали культуры Bacillusspp. B56, Bacillusspp. В50, B. atrophaeus B8 и B. safensis В23. Однако антитела были обнаружены только к B. atropheus B8 и B. safensis В23. Биосурфактантной активностью обладали культуры B23 и В24 B. zhangzhoulensis/B. safensis/B. pumilus, B. atrophaeus B8. Статистически значимой ассоциации между наличием биосурфактантной активности и инвазивностью на анализируемой выборке мы не обнаружили. Таким образом, потенциал пробиотических штаммов на основе микроорганизмов Bacillus subtilis в качестве носителей рекомбинантных вакцинных антигенов представляется нам наиболее перспективным.
Ключевые слова: Bacillus, споровые пробиотики, иммунофлуоресцентная реакция агглютинации, вакцинация, иммуногенность, инвазивность, кормовые вакцины, рекомбинантные вакцины, векторный штамм.
IMMUNOGENICITY AND INVASIVENESS OF THE GENUS Bacillus MICROORGANISMS WITH ORAL ADMINISTRATION
N.A. Donchenko1, 2, Yu.N. Kozlova3, V.Yu. Koptev1, 2, F. Yan4,
Yu.S. Khomenko1, E.V. Nefedova1, V.N. Afonyushkin1, 2, 3 ✉,
O.V. Mishukova3, L.P. Ermakova2, K.V. An1, 4, Ya.V. Novik2
Immunomodulatory effects of genus Bacillus-based probiotics result from the ability of Bacillus to penetrate through the mucous membranes of the gastrointestinal tract into the bloodstream. Creation of recombinant Bacillus-based vaccines with antigens of the most significant and antigenically variable viral and bacterial agents of farm animals (poultry, pigs and cattle) is prospective. The problem of oral vaccination is the nutritional immunotolerance which is due to the involvement of CD4+ and CD8+/Treg lymphocytes in adaptive events that suppress the immune response to the administered antigen. The article for the first time indicates that the invasiveness of the genera Bacillus and Geobacillus strains is important but not the only factor of their immunogenicity. It was found that both B subtillis and B. atrophaeus could be vectors to deliver recombinant antigens. Our objective was to search for Bacillus strains with optimal invasiveness and immunogenicity when used per or and without effects of food immunotolerance. Bacillus strains were provided by the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (ICBFM SB RAS) (22 cultures) and LLC SibAF (Berdsk) (7 cultures). Bacteria were identified by Sanger sequencing of 16S ribosomal RNA. The strains were incubated in 3 % tryptic-soybean broth (TSB), 0.5 % yeast extract (YE) and on 1.5% Bacto agar (BD Biosciences, USA) at 37 °C for 16 h. Bacterial cells were inactivation by heating at 65 °C for 3 h and furacilin adding to a concentration of 0.1 %. Cultures of 29 strains were tested for in vivo immunogenicity in F1 hybrid mice (A/Sn × Balb/C). Animals were orally fed 200 μl of culture fluid of microorganisms of Bacillus and Geobacillus genera at a concentration of 0.7 McF, three times every 7 days. After 3 weeks, blood was sampled for serologic studies. Immunogenicity and invasiveness were evaluated in agglutination test of blood sera with fluorescently labeled O-antigens. Invasiveness upon oral administration was evaluated by a bioassay on 10-day-old Shaver cross chickens (Gallus gallus L.). Every day for 10 days chickens were administered orally a 1-day culture of the tested microorganism at a dose of 200 μl (1 billion CFU/ml). The chickens were slaughtered on day 11, and the bacterial insemination of muscle, liver and heart tissues was assed using meat-peptone agar and meat-peptone broth. Invasiveness of Bacillus strains were tested on C57Black mice. The animals were orally administered 100 μl of bacterial culture once a day for two consecutive days. On day 3, the animals were slaughtered and liver and heart tissue samples were tested using Eugonic agar, meat-peptone agar and meat-peptone broth. For Oil spreading assay of biosurfactant activity, the culture fluid was diluted with distilled water and added with 20 µl of oil. Distilled water was a negative control and SDS (1 % v/v) was a positive control. Destruction of the oil slick was considered a positive test. Only 27.5 % of Bacillus cultures generated production of antibody to their own corpuscular antigens during oral administration to F1 (A/Sn × Balb/C) mice. Among the B. subtilis cultures studied, 71.42 % induced antibody synthesis. Other species which stimulated antibody production were B. atrophaeus B8, isolate B23 attributed to B. zhangzhoulensis/B. pumilus/B. safensis,and B. licheniformis B10. Most tested microorganisms did not cause production of antibodies to their own antigens. B. mucoides/B. weihenstephanensis B31, B. simplex B32, B. thuringiensis B20, B. subtillis, B. amyloliquefaciens 2-15, Bacillus spp. 1'-37-7 had a pathogenic effect with 25 to 50 % death of mice. In all chicks administered orally with the Bacillus cultures, 100 % of breast and thigh muscles, 96 and 52 % of liver and heart, respectively, were contaminated. Invasiveness for mice was assessed by detection of microorganisms in liver and heart samples 18 h after the last oral administration. Bacillus spp. B56, Bacillus spp. B50, B. atrophaeus B8, and B. safensis B23 consistently showed invasiveness. However, antibodies were detected only to B. atropheus B8 and B. safensis B23. B23 and B24 isolates of B. zhangzhoulensis/B. safensis/B. pumilus, and B. atrophaeus B8 had biosurfactant activity. No statistically significant association between biosurfactant propertied and invasiveness is found in the analyzed sample. Thus, the potential of probiotic B. subtilis strains as carriers of recombinant vaccine antigens seems to us the most promising.
Keywords: Bacillus, spore-forming probiotics, immunofluorescent agglutination test, vaccination, immunogenicity, invasiveness, feed vaccines, recombinant vaccines, vector strain.
1ФГБУН Сибирский федеральный научный центр |
Поступила в редакцию |
