doi: 10.15389/agrobiology.2025.1.138rus
УДК 632.4.01/.08::615.015.8
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАБОРАТОРНЫХ МУТАНТОВ ГРИБОВ Fusarium, РЕЗИСТЕНТНЫХ К ФЛУДИОКСОНИЛУ
А.С. ОРИНА1 ✉, О.П. ГАВРИЛОВА1, Т.Ю. ГАГКАЕВА1, Е.П. АРАБИНА1,
А.А. БУРКИН2, Г.П. КОНОНЕНКО2
Фузариоз зерновых культур — вредоносное заболевание, вызываемое несколькими видами грибов Fusarium. Один из наиболее распространенных патогенов — гриб Fusarium graminearum, поражение которым приводит к загрязнению зерна микотоксинами, в том числе дезоксиниваленолом (ДОН) и зеараленоном (ЗЕН), опасными для здоровья человека и животных. В последнее время все чаще в возделываемом зерне обнаруживают гриб F. proliferatum, продуцирующий фумонизины (ФУМ). Обычно при защите растений от патогенов используются фунгициды, однако они могут приводить к развитию резистентности у грибов Fusarium и изменению их свойств, что увеличивает риск снижения эффективности защитных мероприятий и, как следствие, загрязнения зерна микотоксинами. В представленной работе впервые определена чувствительность генетически охарактеризованных штаммов двух видов F. graminearum и F. proliferatum, выделенных из зерна, к флудиоксонилу (ФДО) и получены лабораторные мутанты грибов, резистентные к этому действующему веществу (д.в.). Также впервые установлены достоверные отличия лабораторных мутантов F. graminearum и F. proliferatum от исходных штаммов по скорости роста, патогенности для пшеницы и токсинопродуцирующей способности. Целью работы был сравнительный анализ физиолого-биохимических свойств коллекционных штаммов грибов Fusarium graminearum и F. pro-liferatum и полученных из них в лабораторных условиях мутантов, резистентных к ФДО. Объектами исследования стали 16 моноконидиальных штаммов грибов Fusariumразличного происхождения, идентифицированных по морфологическим признакам как F. graminearum и F. proliferatum, из коллекции Всероссийского НИИ защиты растений (MFG) (ВИЗР, г. Санкт-Петербург, Россия). Для проведения экспериментов штаммы предварительно выращивали на картофельно-сахарозной агаризованной среде (КСА) при 25 °С в темноте. Для молекулярно-генетической идентификации грибов секвенировали фрагмент гена фактора элонгации трансляции EF-1a (tef). В исследовании использовали фунгицид Максим, КС («Syngenta AG», Швейцария), содержащий 25 г/л ФДО, который разводили в стерильной воде до концентрации 5 г/л д.в. Для получения мутантов исходные штаммы Fusarium последовательно культивировали на КСА, содержащем увеличивающиеся концентрации фунгицида. При определении чувствительности грибов к ФДО его концентрации в питательной среде для исходных штаммов составляли 5; 0,5; 0,05 и 0,005 мг/л, для мутантов — 250; 50; 5 и 0,5 мг/л. Из колоний штаммов, выращенных на КСА, вырезали диски диаметром 4 мм и помещали на поверхность питательной среды в центр пластиковой чашки Петри диаметром 85 мм. В контрольном варианте диск помещали на поверхность КСА без добавления фунгицида. Через 3 и 5 сут инкубации соответственно штаммов F. graminearum и F. proliferatum определяли средний диаметр колонии гриба, вычитая диаметр инокуляционного диска. Концентрацию фунгицида, приводящую к 50 % подавлению роста (полумаксимальное ингибирование; IC50) рассчитывали с помощью программы Quest Graph™ IC50 Calculator. Для оценки влияния температуры на скорость роста грибы культивировали при 25 °С и 35 °С в темноте в термостате Innova 44R («Eppendorf», Германия), измеряя диаметр колоний: для F. graminearum соответственно на 3-и и 7-е сут, для F. proliferatum — на 5-е и 7-е сут. Скорость роста определяли как отношение диаметра колонии к числу суток культивирования (мм/сут). Патогенность штаммов оценивали посредством инокуляции отрезков листьев пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Васса. Для изучения токсинообразования штаммы грибов выращивали на автокловированном зерне пшеницы. Количество ДОН и ЗЕН в культурах F. graminearum и ФУМ в культурах F. proliferatum определяли с помощью аттестованных коммерческих иммуноферментных тест-систем (ВНИИВСГЭ, Россия). При культивировании на КСА без фунгицида диаметр колоний исходных штаммов F. graminearumварьировал от 34 до 52 мм на 3-и сут, а исходных штаммов F. proliferatum— от 48 до 64 мм на 5-е сут. Концентрации флудиоксонила (IC50), приводящие к полумаксимальному ингибированию роста мутантов F. graminearumи F. proliferatum, оказались соответственно в 900-60000 и 6-458 раз выше значений IC50 для исходных штаммов. Два штамма F. proliferatum изначально показали высокую резистентностью к ФДО и образовывали ФУМ в количестве, которое в 6 и 22 раза превышало средний показатель для исходных штаммов этого вида. Средняя скорость роста у лабораторных мутантов F. graminearum и F. proliferatum при 25 °С составила соответственно 17,2±1,0 и 12,8±0,2 мм/сут и оказалась на 2,6 и 1,6 мм/сут больше, чем средние показатели у исходных штаммов этих видов грибов. Шесть лабораторных мутантов F. graminearum были патогенными для пшеницы, и при инокуляции на отрезках листьев появлялись некрозы длиной от 14±3 до 44±1 мм, что оказалось в среднем в 1,6 раза меньше, чем у исходных штаммов гриба, тогда как два мутанта F. graminearum не вызывали некрозы в отличие от исходных культур. Все лабораторные мутанты F. proliferatum, как и исходные штаммы, оказались непатогенными при инокуляции листьев пшеницы. Средние количества ДОН и ЗЕН (1,1±0,4 и 7,2±6,3 мкг/г), образуемые мутантами F. gramine-arum, были соответственно в 25 и 16 раз ниже, чем у исходных штаммов (27±16 и 119±72 мкг/г). В среднем мутанты F. proliferatum продуцировали в 4 раза больше ФУМ (900±284 мкг/г), чем исходные культуры (219±63 мкг/г). Полученные результаты демонстрируют неодинаковый характер влияния приобретенной резистентности к ФДО на свойства разных видов Fusarium.
Ключевые слова: грибы Fusarium, флудиоксонил, резистентность, патогенность, микотоксины.
A.S. Orina1 ✉, O.P. Gavrilova1, T.Yu. Gagkaeva1,
E.P. Arabina1, A.A. Burkin2, G.P. Kononenko2
Fusarium head blight is a harmful disease of cereals caused by Fusarium fungi. Fusarium graminearum is among the most widespread fungi in the world and is of great economic importance, which leads to grain contamination with the mycotoxins deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEN) that poses danger to human and animal health. Recently, F. proliferatum, the fumonisins (FUM) producer, has been increasingly discovered in cultivated cereals. Fungicide treatment is the most popular practice for managing pathogens, but also leads to the emergence of fungicide resistance in Fusarium fungi and changes in their features. As a result, the risk of reducing the effectiveness in disease control and increasing a contamination of grain with mycotoxins exists. In this study, the sensitivity of genetically characterized F. graminearum and for the first time F. proliferatum strains isolated from grain, to fludioxonil has been determined, and the laboratory mutants of fungi resistant to this active substance have been generated. Also, for the first time, significant differences between the laboratory mutants and parent strains of F. graminearum and F. proliferatum in terms of growth rate, pathogenicity to wheat and toxin-producing ability have been established. The aim of study was the comparative analysis of physiological and biochemical characters of the parent F. graminearum and F. proliferatum strains with mutants resistant to fludioxonil obtained in the laboratory conditions. The objects of the study were 16 monoconidial Fusarium strainsof different geographical origins from the collection of All-Russian Institute of Plant Protection (MFG) (VIZR, St. Petersburg, Russia), previously morphologically identified as F. graminearum and F. proliferatum. For laboratory experiments, the strains were previously grown on potato sucrose agar (PSA) at 25 °C in the dark. The identification of Fusarium strains was confirmed by sequence analysis of the fragment of gene encoding translation elongation factor EF-1a (tef). The fungicide Maxim (Syngenta AG, Switzerland), containing 25 g/l fludioxonil, was diluted in sterile water to a concentration of 5 g/l of the active ingredient. To obtain F. graminearum and F. proliferatum mutants resistant to fludioxonil, theparent Fusarium strains were sequentially cultured on PSA containing increasing concentrations of the fungicide. When determining the sensitivity of fungi to fungicide, the concentrations of fludioxonil in PSA for the parent strains were 5; 0.5; 0.05 and 0.005 mg/l, and for the mutants 250; 50; 5 and 0.5 mg/l. From colonies of the parent strains and mutants grown on PSA, 4 mm discs were cut out and placed on the nutrient medium in the center of a plastic 85 mm Petri dish. In the control, the disk was placed on the surface of PSA without the fungicide. After 3- and 5-day incubation of the F. graminearum and F. proliferatum strains, respectively, the average diameter of the fungal colony was meaasured excluding the diameter of the inoculation disk. The fungicide concentration resulting in 50 % growth inhibition (half-maximal inhibition concentration; IC50) was calculated using the Quest Graph™ IC50 Calculator program. To assess the effect of temperature on the fungal growth rate, the strains were cultured at 25 °C and 35 °C in the dark in Innova 44R incubator (Eppendorf, Germany), and diameter of F. graminearum and F. proliferatum colonies were measured on days 3 and 7, and on days 5 and 7, respectively. The growth rate was determined as the ratio of the colony diameter to the number of days of culture (mm/day). The pathogenicity of the parent strains and mutants was assessed by the detached leaf assay, according to sizes of necrosis caused by fungal strains after inoculation of the wheat (Triticum aestivum L., cv. Wassa). To assess toxin production, fungal strains were grown on autoclaved wheat grain. The determination of DON and ZEN in F. graminearum culturesand FUM in F. proliferatum cultures was performed using the certified commercial enzyme immunoassay test systems (VNIIVSGE, Russia). When cultured on PSA without fungicide, the colony diameter of the parent F. graminearum strains varied from 34 to 52 mm on day 3, and that of the parent F. proliferatum strains were from 48 to 64 mm on day 5. The IC50 concentrations of fludioxonil resulting in half-maximal growth inhibition for F. graminearum and F. proliferatum mutants were 900-60000 and 6-458 times higher than the IC50 values for the parent strains, respectively. Two F. proliferatum strains initially demonstrated high resistance to fludioxonil and produced FUM 6 and 22 times higher than the average for the other parent strains of this species. The average growth rate of F. graminearum and F. proliferatum mutants at 25 °C was 17.2±1.0 and 12.8±0.2 mm/day, respectively, which was 2.6 and 1.6 mm/day higher than the average values of the parent strains of both species. Six F. graminearum mutants were pathogenic to wheat and caused 14±3 to 44±1 mm necrosis of leaves, which was on average 1.6 times less than that of the parent strains, whereas two F. graminearum mutants did not cause necrosis, unlike the parent strains. All F. proliferatum mutants as well as their parent strains were nonpathogenic to wheat leaves. The average amounts of DON and ZEN (1.1±0.4 and 7.2±6.3 μg/g) produced by F. graminearum mutants were 25 and 16 times lower, respectively, than those of the parent strains (27±16 and 119±72 μg/g). On average, F. proliferatum mutants produced 4 times more FUM (900±284 μg/g) than the parent strains (219±63 μg/g). The obtained results demonstrate the different effects of induced fludioxonil resistance on the characters of different Fusarium species.
Keywords: fungi, fludioxonil, resistance, pathogenicity, mycotoxins.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений, 196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, 2Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии, |
Поступила в редакцию Принята к публикации |
