СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 3, с. 96-101

УДК 634.74:631.53

ОСОБЕННОСТИ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ АКТИНИДИИ
И ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО

Е.А. ТУТЬ, М.Т. УПАДЫШЕВ

Изучали особенности размножения актинидии коломикта (Actinidiakolomikta Maxim.), аргута (A. arguta Planch.), пурпурной (A. purpurea Rehd.), полигама (A. polygama Maxim.), джиральда (A. giraldii Diels.), китайской (A. chinensis Planch.) и лимонника китайского [Schisandrachinensis (Turcz) Baill.] in vitro. Установлены оптимальные сроки изоляции эксплантов, виды и концентрации регуляторов роста.

Ключевые слова: микроразмножение, регуляторы роста, актинидия, лимонник.

Key words: micropropagation, growth regulators, Actinidia, Magnolia vine.

Актинидия и лимонник китайский представляют большой интерес для промышленного и любительского садоводства, поскольку служат богатыми источниками витаминов и биологически активных соединений. В настоящее время ощущается недостаток оздоровленного посадочного материала этих культур, связанный со сложностью и недостаточной изученностью специфики размножения in vitro и оздоровления.
Актинидию обычно размножают семенами, отводками и черенками (1). Данные литературы по микроразмножению актинидии, в особенности видов, которые могут произрастать в условиях Центральной России (актинидии коломикта и аргута), весьма ограничены (2, 3). Чаще встречаются зарубежные сообщения о регенерации растений актинидии китайской (4, 5). Лимонник китайский относится к трудноразмножаемым культурам, в связи с чем его традиционно размножают семенами и корневищной порослью. В литературе сведения об успешной регенерации растений лимонника in vitro отсутствуют. Поэтому увеличение эффективности микроразмножения актинидии и лимонника китайского весьма актуально. К тому же на актинидии и лимоннике обнаружены вирусы, способные влиять на вегетативную и генеративную продуктивность растений (6-9). Поскольку некоторые полигостальные вирусы (например, табачной и огуречной мозаики, скручивания листьев черешни и др.) способны поражать многие ягодные, плодовые, овощные и декоративные культуры, возникает необходимость оздоровления растений актинидии и лимонника. Оздоровление обычно осуществляют с использованием приемов культуры тканей, в связи с чем на первый план выходит отработка элементов технологии микроразмножения.
Важнейшие условия успешной регенерации эксплантов — срок изоляции, соответствующий определенной фазе развития маточных растений, а также вид и концентрация регулятора роста, вводимого в состав питательной среды. Сведения об оптимальном сроке изоляции меристематических верхушек носят противоречивый характер и нуждаются в уточнении применительно к биологическим особенностям культур. Большинство исследователей считает, что наиболее благоприятный срок введения в культуру тканей приходится на период с февраля—марта по май—июнь,  соответствующий фазам вынужденного покоя и начала активного роста побегов (10-12). В ряде случаев наибольший выход растений наблюдался при отборе эксплантов в июне и июле (13).
Цель нашей работы — изучение особенностей размножения актинидии и лимонника китайского на искусственных питательных средах.
Методика. Объектами исследований служили: лимонник китайский (сорта Садовый 1 и Первенец, отборная форма Коломенский); актинидия коломикта (отборные формы 3/3 и 3/1 — женские, сорта Находка, Павловская, ВИР 2 — женские формы, отборная форма 5/5 — мужская); актинидия аргута (семья Золотая коса, форма 2/13 — мужская); актинидия китайская (формы 2 и 21 — женские); актинидия пурпурная (сорт Садовая 1 — женская форма); актинидия джиральда (форма 36 — женская); актинидия полигама (сорт Перчик — женская и мужская формы).
Почки актинидии и лимонника китайского стерилизовали в растворах 0,1 % сулемы в течение 8 мин и высаживали на питательную среду с макроэлементами по Мурасиге и Скугу (1962), микроэлементами по Хараде, гидролизатом казеина (500 мг/л), миоинозитом (100 мг/л), никотиновой кислотой (0,5 мг/л), аскорбиновой кислотой (1 мг/л), тиамином (0,5 мг/л), пиридоксином (0,5 мг/л), сахарозой (30 г/л) и агар-агаром (7 г/л). Испытывали следующие регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП) (0,025-1,0 мг/л), зеатин (0,1-0,5 мг/л), тидиазурон (ТДЗ) (0,05-1,0 мг/л), 2-изопентениладенин (2-iP) (0,5-5,0 мг/л) и настойку семян лимонника (НСЛ) (1,0-6,0 мл/л). Культивировали при 16-часовом фотопериоде, освещенности 2000 лк и температуре 25 °С. Изоляцию эксплантов осуществляли в сроки, соответствующие фазам глубокого и вынужденного покоя (декабрь—февраль), начала плодообразования (июнь) и налива плодов (июль). Почки лимонника китайского брали с маточных растений, находящихся в открытом грунте и в условиях теплицы, актинидии — в открытом грунте. В каждом варианте высаживали по 20-25 эксплантов (повторность неизолированная).

Результаты. Регенерационная способность эксплантов актинидии разных видов и лимонника на этапе введения в культуру зависела от срока изоляции. Так, в летний период возрастала способность растительных тканей к недифференцированному росту, так как почки находились в менее дифференцированном состоянии и число име-ющихся в них пазушных ме-ристем было меньше, чем в фазы покоя. Наибольшая приживаемость эксплантов (в среднем 38-45 %) достигалась при изоляции меристематических верхушек в фазы глубокого и вынужденного покоя (табл. 1). В фазы плодообразования и налива плодов средняя приживаемость по трем видам актинидии снижалась примерно в 2-4 раза. Вместе с тем, меристемы женской формы актинидии коломикта характеризовались высокой приживаемостью при изоляции в фазы покоя и начала образования плодов.
В целом меристематические верхушки у актинидии коломикта приживались лучше, чем у актинидий аргута и полигама — соответственно в 2,4 и 2,9 раза. Экспланты женской формы актинидии коломикта по всем срокам изоляции в среднем характеризовались в 3 раза более высокой приживаемостью, чем мужской формы. Однако при изоляции эксплантов актинидии коломикта в фазу глубокого покоя различия по приживаемости между женской и мужской формами не проявлялись.
Для актинидии аргута и полигама сроки изоляции эксплантов в фазы глубокого и вынужденного покоя также оказались более благоприятными по сравнению с другими сроками. На других культурах введение меристем в культуру в фазу покоя, как правило, благоприятно влияло на их приживаемость и регенерационные процессы.
При введении меристематических верхушек лимонника китайского сорта Первенец в культуру ткани, как и у актинидии, приживаемость зависела от срока изоляции: при высадке на питательную среду в фазы глубокого и вынужденного покоя отмечалась наибольшая (86,7-100 %), в фазу плодообразования — резко снижалась (рис. 1).

Анализ показал, что экспланты актинидии (в среднем по трем формам), изолированные в фазу покоя, также лучше развивались: высота экспланта была на 30-40 % (рис. 2), а число листьев — в 3,2-4,1 раза больше, чем при изоляции в фазу образования плодов. Экспланты актинидии видов коломикта и полигама формировали примерно одинаковое число листьев, аргута — на 32-36 % меньше.
Пол актинидии в ряде случаев значительно влиял на регенерационные процессы у эксплантов: меристемы женской формы вида коломикта не только лучше приживались на питательной среде, но и формировали более облиственную розетку по сравнению с мужской. Разница по числу образовавшихся листьев и высоте побегов у женской и мужской форм актинидий была почти 3-кратной. Исключение составили виды полигама (экспланты мужской формы характеризовались более мощным вегетативным развитием, чем женской) и аргута, у которого развитие меристематических верхушек практически не зависело от пола растения-донора.
В основном гибель эксплантов актинидии происходила вследствие бактериальной (35-65 % случаев) и грибной (25-42 %) инфекций, на другие причины приходилось 10-15 % случаев. У лимонника гибель была в основном обусловлена факторами физиологического характера (65-70 % случаев).
Как известно, для актинидии характерны почки, скрытые в мякоти листовой подушки, что создает определенные трудности при вычленении меристем. К тому же у них (в особенности у актинидии коломикта) вязкий клеточный сок, прилипающий к инструментам во время изоляции. Возможно, с этими морфологическими и биохимическими особенностями связана низкая приживаемость эксплантов и их высокая инфицированность. Изоляция эксплантов в фазы покоя была более благоприятной для приживаемости и развития эксплантов, вероятно, в силу специфического биохимического статуса маточных растений (более высокое содержание в тканях питательных и гормональных веществ), что и обусловливало активные регенерационные процессы в меристемах.
Актинидия и лимонник, как было показано, нуждаются в частых пересадках на свежие питательные среды: при беспересадочном культивировании эксплантов в течение более 60 сут происходило почернение сначала верхней части листьев, далее всех листьев и затем отмирание побегов.
Отличительной особенностью актинидии и лимонника был довольно длительный лаг-период, характеризующийся полным отсутствием ростовых процессов, который в зависимости от вида составлял 12-20 сут (у актинидий аргута, пурпурной, китайской и джиральда он короче, у актинидии коломикта — длиннее). Через 30-35 сут после введения в культуру отмечали образование розеток листьев, причем, как правило, на частях экспланта, контактирующих с питательной средой. Спустя 15-20 сут после посадки в местах среза микрочеренка формировался каллус диаметром до 8 мм. У мужской формы актинидии коломикта 5/5 интенсивный недифференцированный рост приводил к ингибированию органогенеза. Большое число эксплантов лимонника не развивалось в течение нескольких месяцев культивирования. В этой связи важен подбор питательной среды, препятствующей сильному каллусогенезу. Это тем более актуально, что у актинидий китайской и джиральда наблюдали образование микропобегов непосредственно из каллусной ткани. Цвет каллуса зависел от пола растений: у женских экземпляров актинидии коломикта каллус был в основном светло-зеленый, у мужских — интенсивно зеленый или буровато-зеленый. Отмечалась морфологическая разнокачественность листьев у одних и тех же растений актинидии видов китайская и джиральда.
Для преодоления лаг-периода в состав питательной среды вводили НСЛ и различные регуляторы роста (6-БАП, зеатин, ТДЗ и 2-iP).
Наибольшую приживаемость меристем в среднем по трем видам актинидии обеспечивал ТДЗ (табл. 2): на средах с 6-БАП и 2-iP она была в 2,1-2,2 раза ниже, чем на среде с ТДЗ. При этом проявлялась также видовая специфичность: максимальная приживаемость меристем актинидии аргута (75 %) достигалась на среде с 2-iP (5 мг/л), коломикта (60 %) — с ТДЗ (0,1 мг/л), актинидии полигама (60 %) — с ТДЗ (0,05 мг/л).
Благоприятное действие на развитие эксплантов, особенно у актинидий аргута и коломикта, оказывал 6-БАП (для вида аргута ― 0,5 и 1,0 мг/л, коломикта — 0,5 мг/л). Хороший рост побегов в длину у актинидии аргута также стимулировал ТДЗ в низкой концентрации (0,05 мг/л) и 2-iP (1,0 и 5,0 мг/л), у актинидии полигама — ТДЗ (0,05 мг/л). На способность ТДЗ к активной стимуляции органогенеза на других культурах указывают некоторые зарубежные исследователи (14, 15). Такое действие ТДЗ связывают с его способностью модифицировать биосинтез или метаболизм ИУК и этилена и поддерживать их оптимальное содержание в культивируемых тканях экспланта.

Отметим, однако, что при введении в культуру лимонника китайского приживаемость и последующее развитие эксплантов зависели от состояния маточных растений: для развивавшихся в теплице приживаемость была на 23 % выше, чем для росших в открытом грунте (вероятно, в связи с особенностями физиологического состояния), а доля развивающихся эксплантов в первом варианте в 3 раза превышала аналогичный показатель во втором, причем в первом варианте экспланты развивались гораздо активнее как на этапе введения в культуру, так и после первой пересадки.
Интенсивность вегетативного развития у актинидии зависела от видовых особенностей: наибольшее число побегов формировали виды аргута и китайская, наименьшее — джиральда и пурпурная (табл. 3).

Актинидия коломикта по способности к размножению занимала промежуточное положение, хотя по скорости роста побегов в длину она отставала от других видов. Наибольшее разрастание каллуса отмечали у видов китайская и джиральда. У актинидии коломикта, аргута, пурпурная и джиральда уже после первой пересадки на среду для размножения через 40-50 сут культивирования наблюдали спонтанный ризогенез: доля эксплантов с корнями составляла 17 %. При высадке пробирочных растений видов аргута и пурпурная в нестерильные условия их приживаемость достигала 75-86 %, а у побегов без корней — 63 %. Наряду с оптимальным весенним сроком высадки хорошие показатели приживаемости обеспечивали позднелетний и даже позднеосенний сроки.
Таким образом, изучены некоторые особенности размножения ряда видов актинидии и лимонника китайского in vitro. На этапе введения в культуру для эксплантов лимонника китайского и актинидии характерен длительный лаг-период и довольно низкая приживаемость. Для повышения этого показателя и улучшения развития эксплантов актинидии и лимонника китайского целесообразно осуществлять их изоляцию в фазы вынужденного или глубокого покоя и использовать в качестве регуляторов роста тидиазурон, 6-бензиламинопурин и 2-изопентениладенин.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К о л б а с и н а  Э.И. Актинидии и лимонник китайский в России (биология, интродукция, селекция). М., 2000.
2. В ы с о ц к и й  В.А.,  Б а р т е н е в а  Л.В.,  У п а д ы ш е в  М.Т. Введение в культуру дикорастущих видов актинидии: способы размножения in virto. Сб. науч. тр. ВНИИ сад-ва им. И.В. Мичурина. Мичуринск, 1990, вып. 57: 34-40.
3. Р о г о з и н а  Т.А.,  К о л е с н и ч е н к о  В.М. Микроклональное размножение актинидии. В сб.: Проблемы интродукции и экологии Центрального Черноземья. Воронеж, 1997: 131-133.
4. M o n e t t e  P.L. Organogenеsis and plantlet regeneration following in vitro cold storage of kiwifruit shoot tip cultures. Sci. Hor. (Neth)., 1987, 131: 101-106.
5. P r e d i e r i  S.,  M e z z e t t i  B.,  R a n i e r i R. Rigenerazione «in vitro» da foglie di Aktinidia deliciosa cv. Haywerd. Rv. Frutticolt. е ortofloricolt., 1988, 50(11): 69-72.
6. К е л д ы ш  М.А.,  П о м а з к о в  Ю.И. Вирусные и микоплазменные болезни древесных растений. М., 1985.
7. К е л д ы ш  М.А.,  Ч е р в я к о в а  О.Н. Болезни нетрадиционных культур. Защита и карантин растений, 1996, 8: 25.
8. C a c i a g l i  P.,  L o v i s o l o  O. Behaviour of kiwifruit plants (Aktinidia deleciosa) in regard to virus infections. Adv. Hort. Sci., 1987, 1: 11-14.
9. Т у т ь  Е.А.,  У п а д ы ш е в  М.Т. Диагностика вирусов на актинидии и лимоннике методом ИФА. В сб.: Плодоводство и ягодоводство России. М., 2005, т. ХII: 606-611.
10. К л о к о н о с  Н.П.,  С о л о в ь е в а  И.И. Размножение малины методом культуры ткани. Вест. с.-х. науки Казахстана, 1986, 9: 44-47.
11. Л е о н т ь е в - О р л о в  О.А. Размножение индикаторных растений in vitro и контроль за вирусной инфекцией малины. Мат. Респ. науч.-практ. конф. «Проблемы современного садоводства». Киев, 1989, 1: 34-35.
12. У п а д ы ш е в  М.Т. Клональное микроразмножение и особенности регенерации растений ежевики и малины черной in vitro. Канд. дис. М., 1991.
13. А б р а м е н к о  Н.М.,  Ц у р к а н  И.Г. Разработка методов получения исходного безвирусного материала земляники. В сб.: Культура земляники в СССР (докл. симп.). М., 1972: 382-384.
14. S a n k h l a  N.,  D a v i s  T.D.,  S a n k h l a  D. e.a. Reversal of salicylic acid-induced inhibition of growth and organogenesis by thidiazuron. Plant Physiol., 1993, 102(1): 180.
15. V i s s e r  C., Qureshi J.A., Gill R. e.a. Morphoregulatory role of thidiazuron. Substitution of auxin and cytokinin requirement for the induction of somatic embryogenesis in geranium hypocotyls cultures. Plant Phisiol., 1992, 99(4): 1704-1707.

FEATURES OF MICROPROPAGATION OF ACTINIDIA AND Schisandra chinesis (Turcz) Baill

E.A. Tut', M.T. Upadyshev

S u m m a r y

The specific variants of clonal micropropagation in vitro of Actinidia kolomikta Maxim., A. arguta  Planch., A. purpurea Rehd., A. polygama Maxim., A. giraldii Diels., A. chinensis Planch. and Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. were elaborated. The optimal period of explants isolation, favorable composition and dose of growth regulators for each species were revealed.