СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 2, с. 72-77

Физиология и биохимия пищеварения

УДК 636.2:577.151:636.087.7

АКТИВНОСТЬ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ХИМУСА У КОРОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ КОРМОВЫХ
ДОБАВОК С АДСОРБЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ

В.В. ПАРШИНА

В опытах in vitro и in vivo изучали влияние энтеросорбентов на изменение динамики активности амилолитических и протеолитических ферментов химуса 12-перстной кишки у коров холмогорской породы. Установлено, что действие исследуемых добавок в значительной степени обусловлено природой фермента и условиями среды, в которой протекает реакция. Полученные результаты позволяют частично раскрыть механизмы действия некоторых кормовых добавок.

Ключевые слова: коровы, дуоденальный химус, энтеросорбенты, активность ферментов.

Key words: cows, duodenal chime, enteral sorbents, activity of ferments.

В настоящее время в животноводстве достаточно широко используются вещества, обладающие свойствами энтеросорбентов. К ним относятся неорганические природные материалы (цеолиты, бентониты, активированный уголь), синтетические полимеры (полиакриламид в различных модификациях и др.), а также продукты переработки растительного сырья (лигнин, целлюлоза и др.). Известно положительное влияние этих веществ на продуктивные качества крупного рогатого скота (1-3).
Механизм действия энтеросорбентов включает прямые и опосредованные эффекты, которые зависят как от вида сорбента, так и от состояния организма (4). Гидрофильные адсорбенты (силикагели, аскангели, диатомит, бентониты, цеолиты и др.) адсорбируют в желудочно-кишечном тракте водорастворимые биологически активные вещества (макро- и микроэлементы, витамины, ферменты, аминокислоты и др.). Гидрофобные адсорбенты, к которым относится активированный древесный уголь, животной уголь и др., в большей степени будут сорбировать жирорастворимые, в меньшей — водорастворимые вещества (5). В то же время механизмы действия ряда препаратов, используемых в качестве энтеросорбентов, на различные пищеварительные процессы изучены недостаточно.
Целью нашей работы была оценка влияния энтеросорбентов на активность амилолитических и протеолитических пищеварительных ферментов.
Методика. Исследования проводили в лаборатории пищеварения и виварии Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (ВНИИФБиП) на коровах холмогорской породы со средней живой массой 506 кг. Животным накладывали фистулу на рубец и канюлю на 12-перстную кишку за впадением протоков поджелудочной железы (6).  
Основной рацион (ОР) подопытных животных был сбалансирован по базовым питательным веществам согласно детализированным нормам (7). ОР включал силос козлятника восточного, сено разнотравное, патоку кормовую и комбикорм, состоящий из пшеницы, ячменя, подсолнечного шрота и минеральных добавок (премикс ПК-60, соль поваренная, дикальцийфосфат).
На первом этапе методом in vitro была изучена активность протеолитических и амилолитических ферментов при добавлении к ним адсорбирующих веществ (цеолита Хотынецкого месторождения — добавка  Стимул, водорастворимого полимера Солунат, оксида кремния Тиксозил и сухого свекловичного жома) в количествах, эквивалентных рекомендуемым для рациона нормам.
Источниками ферментов служили коммерческие кристаллические препараты трипсина и a-амилазы («Спофа-Прага», Чешская Республика), разведенные фосфатным буфером (pH 6,86), а также натуральный химус. Образцы химуса получали через канюлю 12-перстной кишки. В период взятия проб химуса животные (n = 3) находились на ОР. Инкубацию проводили на водяной бане в течение 10, 20 и 30 мин при изучении активности амилазы и 20, 40 и 60 мин — пепсина.
На втором этапе (in vivo) определяли активность протеолитических и амилолитических ферментов химуса коров, которым изучаемые добавки вводили в рацион. Опыты выполняли методом латинского квадрата (n = 4) по схеме: ОР, ОР + цеолит, ОР + полимер, ОР + жом. Цеолит и полимер добавляли к используемому комбикорму в дозе соответственно 4 и 0,3 % (от массы комбикорма). Сухим свекловичным жомом заменяли патоку (количеством, эквивалентным по питательности). В конце каждого 28-суточного периода этого этапа эксперимента проводили суточный сбор дуоденального содержимого.
В химусе и растворе кристаллических ферментов определяли протеолитическую активность — спектрофотометрически, a-амилолитическую — с применением динитросалицилового реактива (8).
Данные модельного опыта с использованием ферментных препаратов обрабатывали статистически по методу Стьюдента, полученные на оперированных коровах — методом определения достоверности количественных различий результатов исследований, проведенных в динамике на одной группе (9).
Результаты. В модельных опытах при добавлении цеолита и оксида кремния к раствору a-амилазы в течение первых 10 мин инкубации наблюдалось увеличение активности фермента по сравнению с контролем соответственно на 6 и 9 %, после чего происходило заметное уменьшение этого показателя (табл. 1). Внесение полимера стабильно снижало активность a-амилазы в период инкубации. При добавлении измельченного свекловичного жома также происходило подавление активности фермента. На завершающем этапе инкубации наблюдалось сильное подавление активности a-амилазы всеми исследуемыми добавками (Р < 0,01).
При внесении цеолита, полимера и жома в раствор трипсина не отмечали существенного изменения активности фермента на протяжении всего периода инкубации. В то же время оксид кремния значительно (на 75 %) подавлял активность трипсина уже на начальном этапе инкубации. При внесении жома наблюдаемая разница стала достоверной через 40 мин и сохранилась в дальнейшем. Активность трипсина при добавлении полимера была достоверно ниже, чем в контрольных образцах на начальном этапе инкубации (Р < 0,001) и в период 40-60 мин (Р < 0,01). В образцах с цеолитом достоверное уменьшение активности по отношению к контролю наблюдалось только на завершающем этапе инкубации.
Учитывая рост ферментативной активности в контрольных образцах, выявленные изменения мы объяснили действием используемых добавок. Следует отметить, что активность трипсина в опытных образцах, будучи ниже контрольных значений, в процессе инкубации возрастала, тогда как активность a-амилазы последовательно снижалась.

Известно, что активность ферментов в значительной степени зависит от микроокружения молекулы фермента и среды протекания ферментативной реакции. При оценке влияния исследуемых добавок на ферменты, находящиеся в гетерогенной среде натурального дуоденального химуса, установили, что некоторое увеличение a-амилолитической активности на начальном этапе инкубации при добавлении цеолита, жома и оксида кремния к опытным образцам химуса было недостоверным по сравнению с контролем (см. табл. 1). Далее наблюдалось последовательное снижение активности во всех исследуемых образцах, включая контрольные.

Протеолитическая активность в контроле и при инкубации с добавками последовательно возрастала. Внесение цеолита повысило активность протеиназ через 20 и 40 мин соответственно на 4,5 и 28,6 % по сравнению с контролем. Добавление полимера и оксида кремния также способствовало повышению протеолитической активности — в наибольшей степени на начальном этапе инкубации (20 мин) (соответственно на 41 и 50 %). Тем не менее, в дальнейшем стимулирующий эффект утрачивался. Введение в инкубационную среду жома привело к снижению активности протеолитических ферментов на 27,3 % в течение первых 10 мин, однако после 40 и 60 мин инкубации показатель возрастал и превышал контрольные значения соответственно на 3,6 и 18,2 %.
При определении активности основных пищеварительных ферментов в натуральном дуоденальном химусе от подопытных коров, которых содержали на ОР с добавками (цеолит, полимер и жом), было показано (табл. 2), что амилолитическая активность в контроле (ОР) возрастала в течение всего времени инкубации. В химусе, полученном при скармливании сухого свекловичного жома, активность амилазы была ниже по сравнению с контролем.  В то же время наблюдалась тенденция к ее увеличению в течение инкубации, особенно в период 10-30 мин: контрольный показатель вырос на 37 %, амилолитическая активность в пробах химуса от коров, содержавшихся на рационах с цеолитом, полимером и жомом, — соответственно на 11, 10 и 89 %. Последовательный рост активности протеолитических ферментов химуса наблюдался только в образцах, взятых от животных, которые содержались на контрольном рационе (ОР), и дополнительно получавших жом. Следует обратить внимание, что включение в рацион полимера в составе комбикорма привело к значительному увеличению активности протеолитических ферментов химуса 12-перстной кишки. При этом прослеживалась тенденция к постепенному снижению наблюдаемого эффекта. Так, в течение первых 20 мин инкубации активность была выше, чем в контроле, на 138 (Р < 0,01), в интервале с 20-й по 40-ю мин — на 54,5; с 40-й по 60-ю — на 16,7 %.

Обсуждая полученные результаты, отметим следующее. В различном характере действия исследуемых добавок на активность ферментов in vivo и in vitro, на наш взгляд, прослеживается как влияние микросреды, так и проявление функциональной адаптации системы ферментов тонкого кишечника, главным образом секретируемых поджелудочной железой, к изменяющимся условиям в желудочно-кишечном тракте при скармливании адсорбирующих добавок.
В многокамерном желудке коров происходит распределение сорбента в жидкой фазе секретов и других компонентов, с которыми тот или иной препарат поступает в 12-перстную кишку. Вероятно, этап сорбции в кислой среде имеет большое значение, так как сорбент при этом не насыщен и способен связывать метаболиты. Начиная с 12-перстной кишки, процесс сорбции протекает в щелочной среде, содержащей большое количество возможных сорбатов. Очевидно, изменение условий сорбции сказывается на ожидаемом эффекте.
Выявленный нами неодинаковый характер проявления активности амилолитических и протеолитических ферментов по отношению к адсорбирующим веществам в инкубируемой смеси, видимо, обусловлен не только спецификой вносимых добавок, но и особенностями самих ферментов, в первую очередь, очевидно, разницей молекулярной массы (у амилазы поджелудочной железы — 45 000, трипсина — 23 800 Да). Указанный параметр существен, так как размеры молекул фермента должны быть соизмеримы с размерами пор предлагаемых носителей.
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что ферменты физически адсорбировались носителями, что послужило причиной частичной инактивацииαa-амилазы. Характер изменения активности позволяет также говорить о диффузионных ограничениях субстрата и эффекте распределения, что, по мнению некоторых авторов, оказывает заметное влияние на микроокружение молекулы иммобилизованного фермента (10, 11). Вместе с тем у трипсина при инкубации не выявили снижения функциональной активности, что, очевидно, объясняется природой самого фермента и его реакцией на внешние воздействия. Добавление в инкубируемую смесь цеолита и жома способствовало стабилизации активности трипсина через 20 мин с начала инкубации. Значительно более низкие абсолютные показатели активности трипсина в сочетании с ростом протеолитической активности при внесении в инкубат оксида кремния, вероятно, обусловлены его высокими адсорбционными свойствами.
Последовательное снижение амилолитической активности как в контрольных, так и в опытных образцах в модельном опыте с дуоденальным химусом обусловлено протеолизом присутствующими в химусе ферментами. Незначительный эффект, вызванный на начальном этапе инкубации введением в инкубационную смесь цеолита, оксида кремния и жома, вероятно, указывает на их способность защищать от действия протеаз вследствие ограничения межмолекулярных контактов. Полимер, вносимый непосредственно в инкубируемую смесь, не проявляет подобных свойств. В целом эффективного препятствия протеолизу амилолитических ферментов  в инкубируемой среде ни одна из указанных добавок не создала.
Итак, полученные результаты показали, что действие исследуемых добавок в значительной степени обусловлено природой фермента и условиями реакционной среды. При скармливании цеолита с рационом в количестве 4 % от массы комбикорма повышается активность амилазы и  частично стабилизируются протеолитические ферменты в гетерогенной среде химуса коров. Полимер при включении в рацион достоверно увеличивает каталитическую активность протеаз химуса, что, очевидно, указывает на его большее сродство к протеолитическим ферментам. Сухой свекловичный жом в составе рациона повышает активность протеолитических ферментов химуса и снижает активность амилазы. В то же время он способствует пролонгации действия как протеолитических, так и амилолитических ферментов, что, безусловно, является положительным эффектом при использовании его в рационах.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К у з н е ц о в  С.Г. Использование природных цеолитов в животноводстве. М., 1994.
2. Ф а б у л я к  Ф.Г.,  К у л и к  М.Ф.,  Л е в и н т о н  Ж.Б. и др. Полиакриламид в животноводстве /Под ред В.П. Кухаря. Киев, 1990.
3. B o u c q u e  C.V.,  F i e m s  L.O.,  C o t t y n  B.G. e.a. Utilisation de pilpes surpressees ou sechees de betteraves pour les taureaux de boucherie. Li Betteravier, 1985, 19(193): 8-10, 14.
4. А л е к с а н д р о в  В.В.,  П а л а м а р ч у к  А.В. Энтеросорбция — метод эфферентной терапии в ветеринарной медицине. В сб.: Мат. 54-й науч. конф. молодых ученых и студентов. СПб, 2000: 9-10.
5. П е т р у х и н  И.В. Корма и кормовые добавки. Справочник. М., 1989.
6. Методы исследования питания сельскохозяйственных животных /Под ред. Б.Д. Кальницкого. Боровск, 1998.
7. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справ. пос. Изд. 3-е перераб. и доп. /Под ред. А.П. Калашникова, В.И. Фисинина, В.В. Щеглова и др. М., 2003.
8. Методы анализа пищеварительных ферментов. Метод. реком. /Сост. В.А. Галочкин, В.М. Газдаров. Боровск, 1987.
9. А с а т и а н и  В.С. Новые методы биохимической фотометрии. М., 1965.
10. Т р и в е н  М. Иммобилизованные ферменты. М., 1983.
11. Введение в прикладную энзимологию. Уч. пос. /Под  ред. И.В. Березина, К. Мартинека. М., 1982.

ACTIVITY OF AMYLOLYTIC AND PROTEOLYTIC ENZYMES IN COW CHYME UNDER THE ACTION FEED ADDITIONS WITH ADSORPTIVE PROPERTIES

V.V. Parshina

S u m m a r y

In experiments in vitro and in vivo the author studied the influence of adsorbents on change in dynamics of activity of amylolytic and proteolytic enzymes of duodenum chime in cows of the Kholmogorskaya breed. It was established that the action of investigated additions to a great extent was determined enzyme’s nature and medium conditions in which the reaction takes place. The obtained results permit partially to understand the mechanism of action for some feed additions.