Работа поддержана грантом РФФИ № 06-04-96644.

Несмотря на критику в адрес метода, он широко используется в молекулярно-генетических исследованиях популяций, в том числе в опытах с полужесткокрылыми (4-10). Однако в отношении клопов-щитников (надсемейство Pentatomoidea) подобные работы крайне малочисленны: нам известны только две — выполненные с Nezara viridula L.(Pentatomidae) в Бразилии (11) и Eurygaster integriceps Put. (Scutelleridae) в Иране (12).
При соблюдении ряда условий (примерно равные концентрации ДНК, выделенной одним методом, проведение реакции в одинаковых условиях, желательно в одной реакции на одном амплификаторе, с одним набором реактивов в нескольких повторностях) известные недостатки RAPD-PCR не препятствуют успешному использованию метода для целей систематики.
Задачей нашего исследования было определение с помощью метода RAPD-PCR молекулярно-генетического полиморфизма в популяциях клопов — представителей разных таксонов отряда Hemiptera и генетических расстояний между видами для систематизации исследуемых таксонов, а также анализ генетической структуры краснодарской популяции клопа вредная черепашка по RAPD-маркерам.
Методика. Объектом исследования служили от 6 до 33 особей клопов следующих видов: Graphosoma lineatum L., Nezara viridula L., Dolicorys  baccarum L., Eysarcoris incospicnus h-s., Piesodorus lituratus, Palomena prasina (Hemiptera, Pentatomidae), Pyrrhocoris apterus (Hemiptera, Pyrrhocoridae), Coreus marginatus (Hemiptera, Coreidae), Eurygaster integriceps Put.(Hemiptera, Scutelleridae). Клопов собирали зимой 2006 года в лесополосе на территории института Всероссийского НИИ биологической защиты растений (г. Краснодар). Всего было проанализировано 127 особей, относящихся к разным таксонам.
ДНК выделяли СТАВ-методом из целых мелких насекомых, а также из головы, лапок и переднеспинки крупных особей с дополнительной обработкой препаратов РНК-полимеразой и фенолом (13). Амплификацию ДНК и электрофорез выполняли по протоколам, описанным ранее (14). В реакции RAPD-PCR использовали следующие праймеры: 5'-GGTCCCTGAC-3' (OPA06) и 5-'TCTGCCGTGA-3' (GT09).
Кластерный анализ и построение дендрограмм проводили по методу UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetical averages — невзвешенный парногрупповой метод с арифметическим усреднением).
Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Treecon и пакета прикладных программ SPSS.

Результаты. Предварительный скрининг девяти праймеров позволил отобрать два — ОРА06 и GT09 (с наибольшей информативностью по числу синтезируемых полиморфных ДНК-фрагментов и воспроизводимостью при разных концентрациях ДНК), которые были использованы в дальнейшей работе.
В целом по изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА06 было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 — от 12 до 27 (табл. 1, рис. 1). Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА06 и GT09 в зависимости от вида составляло соответственно от 5,6 до 11,7 и от 4,2 до 13,5, средняя степень полиморфизма — соответственно 92,4 и 86,2 %; размеры продуктов амплификации варьировали соответственно от 100 до 2300 и от 170 до 2700 п.н.
По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК-фраг-ментам для двух праймеров (всего в сумме 58 RAPD-маркеров) провели кластерный анализ методом UPGMA и канонический дискриминантный анализ.

Все особи четко распределились в отдельные кластеры в соответствии с видовой принадлежностью (рис. 2). При этом в самостоятельный кластер выделились особи видов Pyrrhocoris apterus и Coreus marginatus, не принадлежащие к семейству Pentatomidae. Один большой кластер сформировали представители видов Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera, Scutelleridae), Graphosoma lineatum, Nezara viridula и Piesodorus lituratus (Hemiptera, Pentatomidae), еще один — Dolicorys baccarum, Palomena prasina и Eysarcoris incospicnus (Hemiptera, Pentatomidae). Несколько неожиданно внешне сходные по морфологии особи видов Nezara viridula и Palomena prasina относились к разным кластерам, что указывает на более значительные генетические различия между этими видами по сравнению с другими исследованными видами клопов-щитников. Кроме того, клоп вредная черепашка Eurygaster integriceps (Scutelleridae)ипредставители сем. Pentatomidae оказались генетически очень близкими.

Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации ДНК (метод RAPD-PCR) у различных представителей отряда Hemiptera. Праймер GT09, маркеры молекулярной массы — стандартный набор рестриктов lPstI; А-И — соответственно Dolicorysbaccarum L., Graphosomalineatum L., Nezaraviridula L., Piesodoruslituratus L., Eysarcorisincospicnus h-s., Eurygasterintegriceps Put., Palomenaprasina, Pyrrhocorisapterus, Coreusmarginatus.

1. Полиморфизм ДНК некоторых представителей отряда Hemiptera по RAPD-маркерам
Вид (семейство)	Праймер	Число амплифицируемых фрагментов ДНК	Степень полиморфизма, %	Размер фрагментов ДНК, п.н.	Набор мономорфных фрагментов ДНК, п.н.	Число фрагментов ДНК на особь
						пределы значений	среднее
Eurygaster integriceps (Scutelleridae) (Pentatomidae?)	ОРА06	26	95,7	170-1400	590	4-11	6,3
	GT09	27	92,6	160-1700	600 320	4-14	10,3
Graphosoma lineatum (Pentatomidae)	ОРА06	25	92,0	150-2000	470 380	5-19	11,5
	GT09	16	93,8	180-1080	470	2-13	6,6
Nezara viridula (Pentatomidae)	ОРА06	23	95,8	280-1400	650 400	2-14	7,8
	GT09	24	87,5	200-2700	620 480 350	7-19	13,5
Dolicorys baccarum (Pentatomidae)	ОРА06	31	96,8	100-1700	780	6-12	8,9
	GT09	29	100,0	170-2100	Не выявлены	4-14	9,3
Eysarcoris incospicnus (Pentatomidae)	ОРА06	35	100,0	150-2300	Не выявлены	9-16	11,7
	GT09	27	100,0	170-1700	Не выявлены	3-15	10,2
Piesodorus lituratus (Pentatomidae)	ОРА06	20	85,0	220-1090	590 540 470 230	6-13	10,3
	GT09	17	88,2	180-2000	620 460	2-13	9,9
Palomena prasina (Pentatomidae)	ОРА06	16	87,5	490-2000	790 780	7-10	8,5
	GT09	12	37,5	180-2300	980 700 530 320 180	7-11	8,8
Pyrrhocoris apterus (Pyrrhocoridae)	ОРА06	20	85,0	280-1900	1250 470 420	4-18	11,5
	GT09	9	88,9	320-1400	750	2-7	4,2
Coreus marginatus (Coreidae)	ОРА06	16	93,8	260-1600	470	3-8	5,6
	GT09	16	87,5	320-2100	800 750	4-10	6,1

Рис. 2. Дендрограмма изученных видов клопов (по методу UPGMA). А-И — соответственно Dolicorys baccarum L., Palomena prasina, Eysarcoris incospicnus h-s., Coreus marginatus, Pyrrhocoris apterus, Graphosoma lineatum L., Nezara viridula L., Piesodorus lituratus, Eurygaster integriceps Put. Шкала вверху — генетические расстояния (по M. Nei, W.-H. Li); справа приведен номер особи (образца).

Канонический дискриминантный анализ в целом подтвердил результаты кластерного (рис. 3). У шести исследуемых видов клопов-щитников генетические расстояния до центроида составляли 9,4-12,7 (у клопа вредная черепашка — 12,0), тогда как у представителей других семейств — 13,9 (Coreus marginatus, Coreidae)и 17,6(Pyrrhocoris apterus, Pyrrhocoridae).

Рис. 3. Дискриминация девяти изученных видов клопов в пространстве первой и второй дискриминантных функций. А-И — соответственно Eurygaster integriceps Put., Nezara viridula L., Piesodorus lituratus, Eysarcoris incospicnus h-s., Dolicorys baccarum L., Graphosoma lineatum L., Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus.

При исследовании молекулярно-генетической структуры краснодарской популяции вредной черепашки Eurogasterintegriceps Put. (табл. 2) на основании оценки частоты встречаемости RAPD-локусов в серии экспериментов (в трех аналитических повторностях при разных концентрациях ДНК в реакционной смеси) определили высоковоспроизводимые RAPD-фрагменты.

2. Частота встречаемости RAPD-фрагментов ДНК, выявляемых в популяции Eurygaster integriceps Put. при использовании разных праймеров (Краснодар, 2006, перезимовавшие особи)
Праймер ОРА06 (n =23)		Праймер GT09 (n = 17)
размер фрагмента ДНК, п.н.	частота встречаемости в популяции, %	размер фрагмента ДНК, п.н.	частота встречаемости в популяции, %
1400	13,0	1700	5,9
1300	13,0	1300	11,8
1200	4,3	1160*	17,6
1160	17,4	1090*	5,9
1000	8,7	1020	11,8
950	17,4	980	23,5
920	21,7	880*	64,7
880	13,0	840	17,6
830	8,7	800*	82,4
790*	26,1	780	29,4
700	4,3	720	11,8
650*	87,0	700	17,6
590*	100,0	600*	100,0
570	4,3	570	52,9
540	8,7	540*	88,2
510*	17,4	480*	94,1
480	26,1	460	5,9
450	47,8	410	41,2
430	21,7	380	41,2
400*	73,9	350	11,8
350	17,4	320*	100,0
300	17,4	300*	76,5
280*	95,6	280	5,9
250	21,8	260	41,2
230	21,8	200	23,5
170	17,4	190	47,1
		160	5,9
* Наиболее выраженные и высоковоспроизводимые ДНК-фрагменты.

Из 26 выявляемых праймером ОРА06 маркерных RAPD-фрагментов ДНК у всех образцов во всех повторностях воспроизводились 7 размером 280, 400, 450, 510, 590, 650 и 790 п.н., из 27 фрагментов, выявляемых праймером GT09, — 9 размером 300, 320, 480, 540, 600, 800, 880, 1090 и 1160 п.н.
Таким образом, по результатам RAPD-анализа девяти исследованных видов клопов можно заключить, что в некоторых случаях морфологически похожие друг на друга виды могут в значительной степени генетически различаться и относительно далеко отстоять друг от друга филогенетически. И, наоборот, выделенные в разные семейства виды могут оказаться очень близки генетически и иметь много общих гомологичных последовательностей ДНК в геноме. Поэтому на основании проведенных исследований нам представляется необходимым более детальное изучение таксономической принадлежности клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put.и других представителей семейства Scutelleridae. Предположение об отнесении вида Eurygaster integricepsPut. к семейству Penta-tomidae ранее также высказывали другие исследователи (15). Изучение генетической структуры краснодарской популяции Eurygaster integriceps Put. с использованием двух RAPD-праймеров позволило определить 16 наиболее выраженных и высоковоспроизводимых RAPD-маркеров, пригодных для анализа молекулярно-генетической изменчивости в популяциях этого вида.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. A d a m s  R.P.,  R i e s e b e r g  L.H. The effects of nonhomology in RAPD bands on similarity and multivariate statistical ordination in Brassica and Helianthus. Theor. Appl. Genet., 1998, 97: 323-326.
2. P o w e l l  W.,  M o r g a n t e  M.,  A n d r e  C. e.a. Comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed., 1996, 2: 225-238.
3. I s a b e l  N.,  B e a u l i e u  J.,  B o u s q u e t  J. Complete congruence between gene diversity estimates derived from genotypic data at enzyme and random amplified polymorphic DNA loci in black spruce. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 6369-6373.
4. S k r o c h  P.,  N i e n h u i s  J. Impact of scoring error and reproducibility of RAPD data on RAPD based estimates of genetic distance. Theor. Appl. Genet., 1995, 91: 1086-1091.
5. C a l d e r o n  C.I.,  D o r n  P.L.,  M e l g a r  S. e.a. A preliminary assessment of genetic differentiation of Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae) in Guatemala by random amplification of polymorphic DNA-polymerase chain reaction. J. Med. Entomol., 2004, 41(5): 882-887.
6. M o y a  A.,  G u i r a o  P.,  C i f u e n t e s  D. e.a. Genetic diversity of Iberian populations of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) based on random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction. Mol. Ecol., 2001, 10(4): 891-897.
7. A b d u l l a h i  I.,  W i n t e r   S.,  A t i r i  G.I. e.a. Molecular characterization of whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) populations infesting cassava. Bull. Entomol. Res., 2003, 93(2): 97-106.
8. L i m a  L.H.C.,  C a m p o s  L.,  M o r e t z s o h n  M.C. e.a. Genetic diversity of Bemisia tabaci (Genn.) populations in Brazil revealed by RAPD markers. Genet. Mol. Biol., 2002, 25(2).
9. R a m i r e z  C.J.,  J a r a m i l l o  C.A.,  d e l  P i i l a r  D e l g a d o  M. e.a. Genetic structure of sylvatic, peridomestic and domestic populations of Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae) from an endemic zone of Boyaca, Colombia. Acta Trop., 2005, 93(1): 23-29.
10. M a r g a r i t o p o u l o s  J.T.,  B a c a n d r i t s o s   N.,  P e k a s   A.N. e.a. Genetic variation of Marchalina hellenica (Hemiptera: Margarodidae) sampled from different hosts and localities in Greece. Bull. Entomol. Res., 2003, 93(5): 447-453.
11. V i v a n  L.M.,  S o s a g o m e z  D.R.,  P a n i z z i  A.R.  Variabilidade genetica de Nezara viridula f. torquata, Nezara viridula f. smaragdula e Nezara viridula f. aurantica (L.)(Heteroptera: Pentatomidae) determinada por RAPD-PCR. In: 49 Congresso Brasileiro de Genetica. Resumos, 2003, 1.
12. S a e e d i  Z.,  E s m a i l i  М.,  A b d - M i s h a n i  С. e.a. Detection of DNA polymorphisms between populations of Eurygaster integriceps Put. in Iran using RAPD-PCR. Iranian J. Agricult., 1999, 30(2): 331-340.
13. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Пер. с англ. /Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа и др. М., 1991.
14. К и л ь  В.И.,  Г о л о в а т е н к о  Н.А.,  К р у т е н к о  Д.В. и др. RAPD-анализ ДНК имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) различных географических популяций. В сб.: Мат. докл. Междунар. конф. «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем». Краснодар, 2004, вып. 2: 209-222.
15. Б е й - Б и е н к о  Г.Я.,  Б о г д а н о в - К а т ь к о в  Н.Н.,  Ч и г а р е в  Г.А. и др. Сельскохозяйственная энтомология. М., 1955.

 

ГНУ Всероссийский НИИ биологической защиты растений, 350039 г. Краснодар-39, e-mail: vlkil@inbox.ru

Поступила в редакцию 7 августа 2006 года

ABOUT DNA POLYMORPHISM IN DIFFERENT BUG SPECIES (Hemiptera) WITH RAPD MARKERS

V.I. Kil’,  V.V. Gronin, D.V. Krutenko, V.Ya. Ismailov

S u m m a r y

In the paper the RAPD results are presented for nine different bug species, which belong to various genera and families.  The molecular-genetic polymorphism of insects was studied with two PCR primers — ОРА06 and GT09. Using the most frequent and reproducible DNA fragments (58 RAPD markers) cluster analysis (UPGMA) and canonical discriminant analysis were conducted. All the 127 insects clearly divided into separate clusters according to their species. So, a separate group was formed by stink bugs (Pentatomidae) including such a species as Sunn pest (Eurygaster integriceps, Scutelleridae). Genetic similarity of Sunn pest to other Pentatomidae species seems to indicate that the tested bugs rather belong to Pentatomidae than to Scutelleridae.