СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 3, с. 83-87

Биотехнологии микроклонального размножения

УДК 633.23:57.086.83:57.04

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ ПОЛЕВИЦЫ ПОБЕГОНОСНОЙ Agrostisstolonifera, ОБЛАДАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К КАДМИЮ И СВИНЦУ

Е.А. ГЛАДКОВ

Разрабатывали биотехнологию получения растений полевицы побегоносной (Agrostisstolonifera), устойчивых к Pb и Cd. Для выделения клеточных линий каллусы культивировали на среде Мурасиге-Скуга при концентрации Cd 10 мг/л, регенерацию и укоренение проводили при концентрации 20-30 мг/л. Было получено 50 растений, устойчивых к Cd. Образцы, устойчивые к Cd, обладали также повышенной устойчивостью к Pb. Аналогичным образом получали растения, устойчивые к Pb.

Ключевые слова:кадмий, Cd, свинец, Pb, клеточная селекция.

Key words: cadmium, Cd, lead, Pb, cell selection.

Известно, что наиболее загрязнены тяжелыми металлами пригороды, существенно — сельскохозяйственные угодья. Содержание в почвах Pb и Cd в некоторых случаях превышает ПДК в десятки раз, что приводит, в частности, к его накоплению в корнеплодах и зеленых овощах. Соотношения между количеством химических элементов в органах и тканях различны и связаны с видовой специфичностью растений и со свойствами самих элементов (1, 2). Например, Cu усиленно накапливается в надземных частях многих растений, особенно овощных культур. В корнеплодах, плодах и клубнях содержание Cu существенно ниже, чем в вегетативных органах, что свидетельствует о незначительном оттоке и слабом передвижении металла при флоэмном транспорте. У плодовых деревьев Cu и Pb аккумулируются преимущественно в листьях и плодах (3), у растений многих видов Cd интенсивно накапливается при высоком содержании в почве (4-10). В органах содержание металлов уменьшалось следующим образом: корни > листья > стебли > соцветия > семена, хотя этот порядок для разных видов может несколько варьировать (6, 8). Следует отметить, что у однодольных и двудольных растений транспорт Cd различается (6, 11), и большая его часть задерживается в корнях именно у однодольных: в надземной части у райграса многолетнего содержалось 9, ежи сборной — 12 % от общего количества Cd в растениях, а у салата и капусты пекинской эти показатели составляли соответственно 45 и 75 %. Механизмы устойчивости могут быть неодинаковыми даже у разных клонов (пример — линии кукурузы В37 и F2) (6, 11).
Действие металлов на растения (травянистые и древесные) проявляется на разных уровнях организации как угнетение роста, хлороз и образование некрозов (12).
Для создания растений, устойчивых к загрязнениям почвы, перспективны современные биотехнологические подходы наряду с традиционными методами селекции. Получены клеточные линии, устойчивые к некоторым тяжелым металлам (13-17), однако регенерация из них фертильных растений остается серьезной проблемой. Была выделена клеточная линия дурмана (сохраняла устойчивость к CdCl2 после 400 генераций в неселективных условиях), табака (росла при содержании в среде 100 мМ CdSO4), Lycopersiconperuvianum (оставалась жизнеспособной при концентрации CdSO4 1,5 мМ и устойчивой после 30 генераций в неселективных условиях); из суспензии клеток культурного томата удалось получить линию, выдерживающую присутствие в среде 5 мМ кадмия (14-17). Отмеченные трудности с регенерацией, вероятно, были связаны с тем, что обычно использовалась прямая селекция и длительное культивирование. Устойчивые растения после клеточной селекции выделили в единичных работах (лен-долгунец с устойчивостью к высокому содержанию Cd), однако семена при этом не формировались (13).
Цель нашей работы заключалась в создании растений газонной травы, устойчивых к Cd и Pb, методами клеточной селекции.
Методика. Объектом исследования была газонная трава — полевица побегоносная (Agrostisstolonifera). Первичный каллус получали из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей 30 г/л сахарозы, 500 мг/л гидролизата казеина и 7 г/л агар-агара; концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) составляла 3 и 5 мг/л (в предварительных опытах — 1-10 мг/л). Семена стерилизовали коммерческим отбеливателем «Белизна», затем раскладывали по 30 шт. в чашки Петри на поверхность агаризованной среды и культивировали при температуре 26 °C, влажности 70 % и освещенностью 2000 лк (длина светового дня — 16 ч). Через 30 сут культивирования получали первичный каллус массой 15-20 мг, который высаживали на селективную среду МС с добавлением солей Cd или Pb. Культивирование отобранных каллусов во втором пассаже выполняли при тех же условиях, что и в первом. Затем проводили регенерацию растений и укоренение на среде Мурасиге-Скуга, увеличивая концентрацию Cd; концентрация Pb(NO3)2оставалась постоянной на каждом этапе. Для проверки устойчивости регенерантов их высаживали в почву, содержащую 50 и 100 мг/кг Cd и 0,4 % Pb(NO3)2 (содержание Cd приводится в пересчете на чистый металл, Pb, поскольку он менее токсичен, ― на указанную соль).
Статистическую обработку данных проводили в программе Excel 2003.
Результаты. Как было показано, каллус формировался с высокой частотой при концентрации 2,4-Д в среде 3 мг/л, регенерационная способность была наибольшей при концентрации 3 мг/л в среде для получения и 1 мг/л — в среде для пассирования каллуса. Частота регенерации растений из каллусных тканей, культивируемых на средах с высоким содержанием гормонов, была ниже, поэтому для дальнейшей работы использовали низкие концентрации 2,4-Д.
Незначительное ингибирующее действие Cd в отношении семян полевицы проявилось уже при содержании 10 мг/л (всхожесть семян составила 90 %), а концентрация 120 мг/л оказалась летальной (табл. 1).

Ингибирующий эф-фект Cd в культуре ткани проявлялся при концентрации 5 мг/л (табл. 2), при концентрации 10 мг/л он усиливался, при 20 и 30 мг/л значительная часть каллусных клеток темнела и погибала, а при 60 мг/л наблюдалась полная гибель клеток, то есть каллусные клетки оказались чувствительнее, чем растения.
Ингибирующее влияние Cd на регенерационную способность клеток также проявлялось при концентрации 5 мг/л с усилением по мере увеличения концентрации. При 60 мг/л у клеток наблюдалась полная утрата регенерационной способности (см. табл. 2). В результате в качестве селективных были выбраны концентрации 20 и 30 мг/л.

У выживших каллусов при концентрации Pb(NO3)2 0,1 и 0,15 % регенерационная способность составляла соответственно 50,5±4,1 и 33,0±2,8 % относительно контроля. Эти концентрации выбрали в качестве селективных.
Таким образом, оказалось, что полевица побегоносная относительно устойчива к Pb и значительно менее устойчива к Cd.
Для получения растений, устойчивых к Cd, мы остановились на ступенчатой схеме селекции, когда концентрация стрессового агента возрастает на каждом последующем этапе культивирования клеток (в отличие от прямой селекции, предусматривающей длительное культивирование при сублетальных концентрациях). Отметим, что в принципе оба метода дают положительные результаты, однако мы применили ступенчатую схему, поскольку пересадка непосредственно на среду с сублетальной концентрацией селективного агента (20 и 30 мг/л) вызывала гибель большинства клеток (имеющиеся в небольшом количестве устойчивые клетки все же погибали вследствие отравления продуктами метаболизма чувствительных). Ступенчатая селекция начиналась на адаптивных концентрациях стрессового агента; после обогащения популяции резистентными клетками условия селекции ужесточались. 
Предложенная нами схема клеточной селекции растений полевицы побегоносной включала: получение каллуса, который (после предварительной оценки токсичности разных доз Cd для культуры клеток и целых растений) последовательно пассировали на среде МС с Cd в концентрациях 10 и 20 мг/л; регенерацию и укоренение на среде МС с Cd (30 мг/л); проверку полученных растений.
Общее число выделенных в селективных условиях регенерантов полевицы побегоносной — 50; большинство из них имело нормальную морфологию. Среди полученных нами устойчивых к Cd клеточных линий растений 90 % вегетировали при его содержании 50 мг/кг так же, как растения в почве без токсиканта. Из 10 образцов, растущих в присутствии Cd в дозе 100 мг/кг почвы, у 8 рост и декоративные качества соответствовали контролю, одно отставало в росте незначительно, одно — значительно при сильном пожелтении. Вероятно, у некоторых устойчивых растений при высоких концентрациях Cd включаются механизмы выведения его из клетки. Известно, например, что у клеток Lycopersiconperuvianum на фоне высокого содержания Cd накопление этого металла не происходило, в то время как на фоне низкого он быстро аккумулировался (14). Мы полагаем, что значительную роль в формировании устойчивости к Cd играют фитохелатины, образующие с ионами тяжелых металлов тиолатные комплексы.
Вероятнее всего, у большинства полученных нами образцов резистентность к Cd объясняется его накоплением в корнях и, соответственно, низким содержанием в надземных органах, так как полевица побегоносная относится к однодольным растениям.
Для получения растений, устойчивых к Pb, была выбрана прямая схема селекции, так как этот элемент значительно менее токсичен, чем Cd. В соответствии с ней для отбора устойчивых клонов первичный каллус культивировали на средах с 0,1 и 0,15 % Pb(NO3)2 (как и в варианте с Cd, предварительно оценивали влияние разных доз токсиканта на культуру клеток и целые растения).
В процессе отбора происходило изменение выживающих эксплантов: уменьшалась эмбриогенная способность ткани, нерастущие экспланты приобретали темный цвет, некротизировались.Светлые увеличившиеся в размере экспланты пересаживали на селективную среду МС, содержащую 0,1 и 0,15 % Pb(NO3)2, и после двух таких пассажей каллусы переносили на среду для регенерации с 0,1 % Pb(NO3)2.  
Для двух использованных селективных доз (0,1 и 0,15 %) из полученных каллусов (по 250 в каждом варианте) отобрали соответственно 78 и 50 устойчивых клонов, 33 и 14 регенерантов in vitro и 8 и 6 регенерантов в почве.
Следует отметить, что при селекции в более жестких условиях ― на среде МС с 0,15 % Pb(NO3)2 каллусная ткань частично утрачивала жизнеспособность в течение 2-4 нед, у эксплантов проявлялись свойства неэмбриогенного каллуса и лишь некоторые клоны росли и сохраняли регенерационную способность. В общей сложности было получено 14 растений, устойчивых к Pb.
Известно, что зерновые (особенно овес) толерантны к загрязнению почвы Pb, газонные травы (овсяница, райграс многолетний) — относительно устойчивы (6, 11); высокой устойчивостью к свинцу характеризуется кукуруза. В наших опытах полевица побегоносная (как некоторые другие газонные травы) проявила относительную устойчивость к Pb.
Итак, с использованием методов клеточной селекции (ступенчатой с нарастанием доз селективного агента — в варианте с Cd и прямой — в варианте с Pb) из каллусной ткани полевицы побегоносной (Agrostisstolonifera) было получено 50 растений, устойчивых к Cd, и 14 — к Pb. Образцы, устойчивые Cd, обладали также повышенной резистентностью к Pb.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Г у р а л ь ч у к  Ж.З. Механизмы устойчивости растений к тяжелым металлам. Физиол. и биохим. культ. раст., 1994, 26(2): 107-118.
2. Ж е м к о в а  Л.Н.,  Б и р ю к о в а  З.В.,  Т е р е х о в а  Т.С. и др. Содержание тяжелых металлов в органах растений. Мат. Респ. науч.-практ. конф. «Проблемы использования, воспроизводства и охраны лесных ресурсов». Йошкар-Ола, 1989, 1: 135-136.
3. Е д г о р о в а  Д.Ш.,  А л и м д ж а н о в а  Д.Р. Мониторинг плодовых деревьев в условиях загрязнения тяжелыми металлами. Тез. докл. конф. «Биология — наука XXI века». Пущино, 2003: 167.
4. М е л ь н и ч у к  Ю.П. Влияние ионов кадмия на клеточное деление и рост растений. Киев, 1990: 144-148.
5. Н е с т е р о в а  А.Н. Действие тяжелых металлов на корни растений. 1. Поступление свинца, кадмия и цинка в корни, локализация металлов и механизмы устойчивости растений. Биол. науки, 1989, 10: 72-86.
6. П о к р о в с к а я  С.Ф. Регулирование поведения свинца и кадмия  в системе почва—растение. М., 1995.
7. Растения в экстремальных условиях минерального питания /Под ред. Н.В. Алексеевой-Поповой. Л., 1983.
8. Т а л а н о в а  В.В.,  Т и т о в  А.Ф.,  Б о е в а  Н.П. Изменение уровня АБК в растениях при действии стресс-факторов разной природы. Мат. IV Междунар. конф. «Регуляторы роста и развития растений». М., 1997: 38-39.
9. Т а л а н о в а  В.В.,  Т и т о в  А.Ф.,  Б о е в а  Н.П. Влияние ионов кадмия и свинца на рост и содержание пролина и АБК в проростках огурца. Физиол. раст., 1999, 46(14): 164-167.
10. Г л а д к о в  Е.А.,  Д о л г и х  Ю.И.,  Г л а д к о в а  О.В. и др. Экологические стрессы у растений. Уч. пос. М., 2004.
11. А л е к с е е н к о  В. А.,  А л е щ у к и н  Л. В.,  Б е з п а л ь к о  Л. Е. и др. Цинк и кадмий в окружающей среде. М., 1992.
12. И л ь и н  В.Б. Тяжелые металлы в системе почва—растение. Новосибирск, 1991: 151.
13. Г о н ч а р у к  Е.А. Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-догунца из клеточных и тканевых культур in vitro. Канд. дис. М., 2000.
14. B e n e t z e n  J.L.,  A d a m s  T.L. Selection and characterization of cadmium-resistant suspension cultures of the wild tomato Lycopersicon peruvianum. Plant Cell, 1984, 3: 258-261.
15. D o m o z l i c k a  E.,  O p a t r n y  Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and  the selection of potentially Cd-resistant cell lines. Biol. Plant., 1989, 31(1): 19-27.
16. H i t o s h i  O.,  N o r i y k i  I.,  K u n i o  I. e.a. Cadmium tolerance of calli induced from roots of plants with differences in cadmium tolerance. Soil Sci. Plant Nutr., 1994, 40(2): 351-354.
17. H u a n g  B.,  H a t c h  E.,  G o l d s b r o u g h  P.B. Selection and characterization of cadmium tolerant cells in tomato. Plant Physiol., 1987, 52: 211-221.

BIOTECHNOLOGICAL METHODS OF OBTAINING OF Agrostis stolonifera  PLANTS RESISTANT TO Cd AND Pb

E.A. Gladkov

S u m m a r y

The author develops the biotechnology of obtaining Agrostis stolonifera plants resistant to Pb and Cd. To screen some cells lines the calli was cultivated on the MS medium with sublethal Cd concentration of 10 mg/l, after that the initiation shoot regeneration from the selected calli on the medium with sublethal Cd concentration of 20-30 mg/l was made. The 50 plants resistant against Cd were obtained. The plants resistant against Cd had simultaneously a resistance to Pb. The plants resistant to Pb were obtained similarly.