СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, № 3, с. 24-32

УДК 661.188.1:579.69:577.15

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ БИОТЕХНОЛОГИИ УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА БИОДИЗЕЛЯ ИЗ
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Е.Н. ДИРИНА, А.Ю. ВИНАРОВ, В.А. БЫКОВ

 На основании анализа данных литературы обсуждаются требования к биотехнологиям утилизации глицеринсодержащих отходов производства биодизеля и других производств. Предложена схема такой технологии на основе нестерильной ферментации микробными ассоциациями, обсуждается ее экономическая эффективность.

Ключевые слова: глицерин, биотопливо, биодизель, утилизация отходов, микробные ассоциации, анаэробная биотрансформация, аэробная ферментация глицерина, технологическая схема, полигидроксиалканоаты, биопластики.

Key words: glycerin, biofuel, biodiesel, wastes utilization, mixed microbial cultures, anaerobic biotransformation, aerobic glycerin fermentation, technological scheme, polyhydroxialkanoates, bioplastics.

Как известно, глицерин — один из основных компонентов органических отходов при производстве биотоплива, пищевой и косметической продукции. Значительное количество глицерина образуется при промышленной перегонке спирта в ректификационных колоннах и получении биоэтанола из растительного сырья, а также в процессе производства биодизеля, где глицерин является основным побочным продуктом.

В этой связи утилизация отходов со значительным содержанием глицерина занимает одну из ключевых позиций в организации экологически безопасных и экономически эффективных производств (рис. 2). Необходимо также отметить, что некоторые авторы считают производство биодизельного топлива (например, из сои или подсолнечника) нерентабельным, поскольку энергия, затрачиваемая на его производство, больше получаемой при использовании топлива (3, 4). Однако, учитывая ряд несомненных преимуществ развития альтернативных (в том числе экологически чистых) технологий получения топлива из возобновляемого растительного сырья, экономическую рентабельность такого производства можно обеспечить, получая ценные продукты из образующихся отходов, в частности глицерина, с использованием микробиологического синтеза.

В настоящее время можно выделить два направления технологий утилизации или переработки глицеринсодержащих отходов промышленных предприятий — основанные на физико-химических и на биологических методах (5, 6).
Физико-химические методы очистки глицеринсодержащих стоков включают в себя несколько этапов, а именно: на первом этапе жиры и другие органические компоненты отделяют центрифугированием и/или фильтрацией; окончательную очистку обычно производят вакуум-выпариванием. Все более широкое применение для очистки глицериновых стоков производства биодизеля находят также методы электродиализа и нанофильтрации (7). Этими способами крупнейшие производители биотоплива (биоэтанола и биодизеля) проводят очистку глицерина с последующей его реализацией в разных отраслях промышленности. Однако стремительное развитие объемов производства биотоплива привело к перепроизводству глицерина, и в настоящее время многие предприятия вынуждены нести расходы по хранению побочного продукта производства.

Таким образом, на сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений представляется конверсия глицерина в целевые продукты с помощью химического или микробиологического синтеза. При этом следует отметить, что для химической трансформации одним из критериев эффективности процесса является использование очищенных фракций глицерина, в то время как в микробиологическом синтезе можно использовать отходы без предварительной обработки.
Х а р а к т е р и с т и к а   о т х о д о в   п р о и з в о д с т в а   б и о- д и з е л я,   с о д е р ж а щ и х   г л и ц е р и н. Стоки производства биодизеля, как правило, представляют собой смесь глицерина, метанола, воды, следов катализаторов, свободных жирных кислот, не вступивших в реакцию моно-, ди- и триглицеридов, метилового эфира и др. (табл. 1). Такие стоки принято называть неочищенным глицерином. Они имеют цвет от желтого до темно-коричневого. Анализ состава неочищенного глицерина позволяет сделать заключение о возможности его использования микроорганизмами в качестве субстрата без предварительной обработки.
Б и о л о г и ч е с к а я   т р а н с ф о р м а ц и я   г л и ц е р и н а.  Процесс биотрансформации глицерина может проходить в анаэробных и аэробных условиях за счет окисления, неполного окисления (окислительного брожения) и сбраживания субстрата бактериями родов Enterobacter, Clostridium, Citrobacter, Alcaligenes и др. Рассмотрим подробнее процесс биотрансформации глицерина в аэробных и анаэробных условиях.
А н а э р о б н а я   б и о т р а н с ф о р м а ц и я   г л и ц е р и н а.  Производство 1,3-пропандиола. Биосинтез 1,3-пропандиола в клетках микроорганизмов идет по окислительному метаболическому пути. Образующийся двухатомный спирт применяется в составе композитов, клеев, ламинатов, растворителей и других продуктов химического синтеза. Эффективность биотрансформации коррелирует с активностью клеточного фермента глицеролдегидрогеназы (8).
Для биосинтеза могут использоваться как природные, так и генетически модифицированные микроорганизмы. Так, описан выделенный из почвы штамм Clostridiumbutyricum, утилизирующий глицерин в диапазоне рН от 6,0 до 7,5 (оптимум 6,5) при барботаже азотом. Наибольшая продуктивность штамма, при которой 110 г глицерина метаболизируется в 56 г 1,3-пропандиола в течение 29 ч, обеспечивается при ферментации отъемно-доливным методом и начальной концентрации глицерина в среде 5 % (табл. 2) (9). У бактерии Enterobacteragglomerans максимальная продуктивность составляет 0,61 моль 1,3-пропандиола на 1 моль глицерина при исходной концентрации субстрата от 71 до 100 г/л. При более низкой концентрации (20 г/л) продуктивность снижается до 0,51 моль/моль (10).
Изучены и детально охарактеризованы штаммы бактерий Klebsiellapneumoniae и Citrobacterfreundii, продуцирующие 1,3-пропандиол в концентрациях соответственно 61 и 35 г/л. Наряду с 1,3-пропандиолом штамм C.freundii продуцировал ацетат, а штамм K.pneumoniae — этанол в различных концентрациях и широкий спектр биопродуктов (11). Биотрансформация глицерина в 1,3-пропандиол культурой C. freundii была оптимизирована в условиях непрерывной ферментации, при этом наибольшую продуктивность культуры наблюдали в условиях лимитирования по субстрату (глицерину) (12). Анаэробная деградация глицерина бактериями Desulfovibriocarbinolicus и D. fructosovorans была исследована как в условиях монокультуры, так и при совместном выращивании с Methanospirillumhungatei. Установлено, что D. carbinolicus метаболизирует глицерин в 3-гидроксипропионат с образованием сульфидов в чистой культуре и метана в ассоциациях. Максимальная скорость роста штамма D. carbinolicus составляла 0,063 ч-1 в чистой культуре и 0,014 ч-1 в ассоциации (13).

Пять видов бактерий рода Clostridium (C. acetobutilicum, C. butylicum, C. beijerinkii, C. kainantoiиC. butyricum) в процессе анаэробной ферментации также образуют 1,3-пропандиол, причем C. butylicum при рН 6,5 конвертирует 61 % субстрата в целевой продукт (14). Описаны также два штамма Clostridium, метаболизирующие глицерин в ацетат и бутират (15, 16).
При изучении влияния смешанных субстратов (глюкоза—глицерин) на метаболизм C. butylicum было показано, что в случае чистого глицерина 43 % субстрата использовалось для конструктивного метаболизма и 57 % — на синтез 1,3-пропандиола. В варианте со смешанным субстратом глюкоза использовалась микроорганизмами для поддержания жизнедеятельности, а глицерин на 92-93 % конвертировался в 1,3-пропандиол (17).

П р и м е ч а н и е. Пропуски означают отсутствие данных.

П р и м е ч а н и е. Пропуски означают отсутствие данных.

Из известных микробных культур наибольшей продуктивностью при биотрансформации глицерина в 1,3-про-пандиол характеризуется генетически модифицированный штамм Esherichiacoli (18) (рис. 3), представляя, тем самым, значительный интерес для промышленности. В настоящее время с использованием генетически модифицированных бактерий 1,3-пропандиол производится компаниями Dupont Tate, Lyle и Shell.
Производство биогаза. У метаногенных бактерий глицерин ферментируется в процессе алканогенеза в ацетат с дальнейшей трансформацией в метан (19, 20). Анализ научной, патентной и технической информации показал, что биотрансформация глицерина в биогаз ― новая задача, а сам процесс не изучен в достаточной степени.
В работах Университета Миссисипи установлено, что мезофильные метаногенные микроорганизмы при ассимиляции глицерина в анаэробных условиях способны продуцировать диоксид углерода и метан. В лабораторных исследованиях при лимите основных минеральных компонентов в среде продукция биогаза бактериальной культурой возрастала на несколько десятков процентов (21). В исследованиях по применению отходов производства биодизеля с высоким (15-18 %) содержанием глицерина для производства биогаза у селекционированной ассоциации микроорганизмов отмечена продуктивность 979 мл биогаза из 1 мл глицерина при скорости подачи субстрата в биореактор 4 кгŁм-3Łсут-1 (22). Предварительная оценка применения глицерина в качестве дополнительного субстрата (добавление в количестве 6 % к смеси свиного навоза и растительных отходов) выявила увеличение продуктивности метаногенных бактерий на 19 % (23).

Таким образом, имеющиеся данные по разработке технологии получения метана указывают на эффективность применения глицерина в качестве единственного источника углерода или компонента, добавляемого к традиционным субстратам, и позволяют предложить схему его включения в технологию производства биогаза (рис. 4).
А э р о б н а я   ф е р м е н т а ц и я   г л и ц е р и н а.  Процесс аэробной ферментации позволяет получить более широкий спектр целевых продуктов, в том числе полигидроксиалканоаты (ПГА), которые служат основой для биопластиков, полиглюкозу, а также L-a-глицерофосфат и лимонную кислоту. Так, у дрожжей Candidautilis показана способность ассимилировать глицерин и другие трикарбоновые субстраты в значительно большей степени, чем, например, у пекарских (24), что объясняется высокой активностью дрожжевой глицеролкиназы и образованием значительных количеств митохондриального L-a-глицерофосфата. Штаммы дрожжей Torulopsismolishiana(25) и Zygowilliapini (26), которые в аэробных условиях утилизируют глицерин наряду с сахарами и одноатомными спиртами, предложено использовать для очистки сточных вод.
Биотрансформация глицерина с образованием лимонной кислоты. В настоящее время технология производства лимонной кислоты, широко применяемой в пищевой промышленности в качестве вкусоароматической добавки и консерванта, основана на ферментации углеводсодержащих субстратовс использованиемAspergillusniger. Источником углерода обычно служат меласса, гидролизаты растительного сырья и т.п. Однако их стоимость постоянно возрастает, поэтому поиск альтернативных видов сырья становится все более актуальной научно-практической задачей.
Как известно, метаболизм глицерина осуществляется через синтез пирувата с образованием ацетил-коА. Определенные группы микроорганизмов могут трансформировать его в лимонную кислоту. Так, 27 штаммов дрожжей Yarrowialipolytica, а также Aciculoconidiumaculeatum, C. hispaniensis и C. bentonensis были протестированы на способность продуцировать лимонную кислоту при выращивании на средах с глицерином в качестве единственного источника углерода в условиях лимита по азоту. Все штаммы Y. lipolytica выделяли лимонную кислоту в разных концентрациях. У наиболее продуктивного штамма Y. lipolytica NRRL YB-423  продукция лимонной кислоты составила 21,6 г/л при содержании глицерина в субстрате 40 г/л (выход 54 %). В дальнейшем установили оптимальное для культивирования этого штамма соотношение углерода и азота в питательной среде, которое равняется 343 (27).
Производство полигидроксиалканоатов (ПГА). ПГА — класс природных полиэфиров, по структуре сходных с синтетическими полимерами. В настоящее время ПГА нашли применение в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Известно как минимум 100 видов мономеров гидроксикислот, которые могут входить в состав ПГА, и этот список продолжает расти. Для биосинтеза ПГА из различных отходов сельскохозяйственного производства, в том числе содержащих значительное количество глицерина, предложено использовать штаммы Alcaligeneslatus (28). Метаболизм указанного класса соединений идет через образование пирувата. Накопление ПГА в клетках бактерий отмечается при лимите среды по азоту и в условиях интенсивной аэрации, причем изменение содержания кислорода приводит к повышению содержания полиглюкозы, которая также может служить целевым продуктом метаболизма глицерина.
Анализ существующих методов биотрансформации глицерина показывает, что на сегодняшний день хорошо изучены процессы его анаэробной деградации с получением 1,3-пропандиола и в меньшей степени представлены данные по аэробной утилизации этого трехатомного спирта.
П р и м е н е н и е   м и к р о б н ы х   а с с о ц и а ц и й   д л я   б и о т р а н с ф о р м а ц и и   г л и ц е р и н а.Описанные выше биопроцессы в основном реализуются в условиях стерильной ферментации. Однако стерилизация аппаратуры и поддержание асептических условий существенно повышают стоимость технологического процесса. В этой связи актуальным практическим приложением исследований по биоутилизации глицерина являются работы последних лет по использованию смешанных культур микроорганизмов (устойчивых природных ассоциаций) для высокоинтенсивной нестерильной ферментации в промышленных условиях.
В частности, предложено использовать микробную ассоциацию сульфатредуцирующих бактерий для анаэробной переработки глицерина в 1,3-пропандиол, пропионат и ацетат (29, 30). Показано, что присутствие сульфат-ионов направляет метаболизм на продуцирование 1,3-пропандиола в качестве минорного продукта, а отсутствие сульфат-ионов — на синтез всех указанных веществ. Аэробная утилизация глицерина также может осуществляться с применением природной бактериальной ассоциации в условиях нестерильной ферментации. При этом, например, для ПГА продуктивность у смешанных культур такая же, как у чистых культур генетически модифицированных микроорганизмов  (порядка 80 % в расчете на субстрат в виде чистого глицерина), а расходы на обслуживание нестерильных установок значительно ниже, чем в случае стерильных.
Условия отбора ассоциации микроорганизмов зависят от целевого продукта. Селекцию можно проводить при периодическом, непрерывном или отъемно-доливном культивировании с использованием питательной среды, в которой единственным источником углерода является глицерин.

С р а в н е н и е   р а з л и ч н ы х   т е х н о л о г и й   б и о т р а н с- ф о р м а ц и и   г л и ц е р и н а. Анализ объемов энергопотребления и востребованности целевого продукта при разных технологиях биотрансформации показывает (табл. 3), что получение лимонной кислоты, биогаза  и полиэфиров (двух последних соединений в особенности) представляет значительный интерес для исследований и имеет большой потенциал применения в различных отраслях промышленности.

В ы б о р   ц е л е в ы х   п р о д у к т о в   у т и л и з а ц и и   г л и- ц е р и н а.Одними из наиболее перспективных таких продуктов являются ПГА. Как уже отмечалось, по физико-химическим свойствам они сходны с термопластиками, получаемыми из нефти, но в отличие от них синтезируются из возобновляемого сырья, легко поддаются биодеградации и перспективны как материалы, способные заменить обычные пластики (31). Однако препятствием для замещения обычной пластмассы биоразлагаемой служат производственные затраты, обусловленные в первую очередь стоимостью субстрата и экстракции полимера из биомассы микроорганизмов. Снижение расходов хотя бы по одной из этих составляющих позволило бы в значительной степени уменьшить и себестоимость целевого продукта — ПГА.
Отметим, что решением проблемы биоутилизации глицеринсодержащих отходов при одновременном получении ПГА, с одной стороны,  для многих предприятий (включая производящие биодизель) снимаются вопросы экологизации технологий, с другой — обеспечивается выпуск дополнительного практически значимого продукта, представляющего собой основу биопластиков.

В настоящее время стоимость ПГА, произведенных с использованием A. eutrophus (природный штамм), составляет 16 USD/кг. Коммерчески оправданная стоимость этих полимеров — 5-6 USD/кг. Она может быть достигнута при удешевлении субстрата (использование глицериновых стоков производства биодизеля) и применении нестерильной ферментации. Наиболее перспективной нам представляется схема биосинтеза ПГА из отходов производства биодизеля с использованием естественных природных ассоциаций микроорганизмов в условиях нестерильной ферментации (рис. 5) (схема также может применяться для утилизации глицеринсодержащих отходов других промышленных предприятий). Предлагаемая биотехнология утилизации позволяет, например, получить из 1 т рапса примерно 270 кг биодизеля и 10 кг ПГА, а также около 700 кг белково-витаминных кормовых добавок.
Итак, предложен биотехнологический метод, позволяющий снизить стоимость биодизеля за счет производства дополнительных целевых продуктов из отходов производства, в частности из глицерина. Такая биотехнология позволяет получить порядка 3 кг полигидроксиалканоатов (ПГА) на 100 кг биодизеля при стоимости 1 кг около 6 €. Однако следует отметить, что подобный экономический эффект возможен при нестерильной ферментации с использованием микробных ассоциаций. Выполняемые в настоящее время в этой связи разработки представляются весьма перспективными.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. T h o m p s o n  J.C.,  H e  B.B. Characterization of crude glycerol from biodiesel production from multiple feedstocks. Appl. Engin. in Agricul., 2006, 22(2):261-265.
2. http://www.biodiesel.org
3. P i m e n t e l  D.,  P a t z e k  T.W. Ethanol production using corn, switchgrass, and wood; Biodiesel Production Using Soybean and Sunflower. Nat. Resources Res., 2005, 14(1): 65-76.
4. P a t z e k  T.W. A statistical analysis of the theoretical yield of ethanol from corn starch. Nat. Resources Res., 2006, 15(3): 205-212.
5. Patent RU 2117639.
6. Patent RU 2023687.
7. http://www.eetcorp.com.
8. B a b e l  W.,  H o f m a n n  K.H. The relation between the assimilation methanol and glycerol in yeasts. Arch. Microbiol., 1982, 132(2): 179-184.
9. B i e b l  H.,  M a r t e n  S.,  H i p p e  H. e.a. Glycerol conversation to 1,3-propanediol by newly clostridia. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 36(5): 592-597.
10. B a r b i r a t o  F.,  C a m a r a s a - C l a r e t  C.,  G r i v e t  J. e.a. Glycerol fermentation by a new 1,3-propanediol-producing microorganism: Enterobacter agglomerans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 43(5): 786-793.
11. H o m a n n  T.,  T a g  C.,  B i e b l  H. e.a. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol by Klebsiella and Citrobacter strains. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1990, 33(2): 121-126.
12. B o e n i g k  R.,  B o w i e n  S.,  G o t t s c h a l k  G. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol in continuous cultures of Citrobacter freundii. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 38(4): 453-457.
13. Q a t i b i  A.,  B e n n i s s e  R.,  J a n a  M. e.a. Anaerobic degradation of glycerol by Desulfovibrio fructosovorans and D. carbinolicus and evidence for glycerol-dependent utilization of 1,2-propanediol. Curr. Microbiol., 1998, 36(5): 283-290.
14. F o r s b e r g  C. Production of 1,3-propanediol from glycerol by Clostridium acetobutilicum and other Clostridium species. Appl. Environ. Microbial., 1987, 53(4): 639-643.
15. Q a t i b i  A.I.,  C a y o l J.L., G a r c i a J.L. Glycerol and propanediols degradation by Desulfovibrio alcoholovorans in pure culture in the presence of sulfate, or in syntrophic association with Methanospirillum hungatei. FEMS Microb. Let., 1991, 85(3): 233-240.
16. M o o r e  T. Isolation and characterization of two glycerol-fermenting clostridial strains from a pilot scale anaerobic digester treating high lipid-content slaughterhouse waste. J. Appl. Microbiol., 1999, 86(3): 412-420.
17. A b b a d - A n d a l o u s s i  S.,  A m i n e  J.,  G e r a r d  P. e.a. Effect of glucose on glycerol metabolism by Clostridium butyricum DSM 5431. J. Appl. Microbiol., 1998, 84(4): 515-522.
18. US Patent 5 821 92.
19. С i r n e  D.G., P a l o u m e t  X., B j u r n e s s o n  L. e.a. Anaerobic digestion of lipid-rich waste ― effects of lipid concentration. Renew. Energy, 2005, 32: 956-975.
20. W e l a n d e r  P., M e t c a l f  W. Loss of the mtr operon in Methanosarcina blocks growth on methanol, but not methanogenesis, and reveals an unknown methanogenic pathway (www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0502623102).
21. H a r t e n b o w e r  B., F r e n c h  W., H e r n a n d e z  R. e.a. Biogas production using glycerol, the biodiesel by-product, as the carbon source (http://aiche.confex.com/aiche/2006/techprogram/P64103.HTM Friday, 17 Nov. 2006).
22. H u tňň a n  M.,  B o d í k  I.,  P e t h e ö o v á  T. e.a. Anaerobic treatment g-phase ― by-product of biodiesel production. Proc. 34th Intern. Conf. of SSCHE. Tatransk´e Matliare, Slovakia, 2007.
23. A m o n  Th., A m o n  B., K r y v o r u c h k o  V. e.a. Optimising methane yield from anaerobic digestion of manure: Effects of dairy systems and of glycerine supplementation. In:  Greenhouse gases and animal agriculture: An Update. Proc. 2nd Intern. Conf. on Greenhouse Gases and Animal Agriculture. Zurich, Switzerland, 2006, 1293: 217-220.
24. G a n c e d o  C.,  G a n c e d o  J.M.,  S o l s  A. Glycerol metabolism in yeasts. Pathways of utilization and production. European J. Biochem., 1968, 5(2): 165-172.
25. Patent RU 442209.
26. Patent RU 451742.
27. L e v i n s o n  W.,  K u r t z m a n  C.,  K u o  T. Characterization of Yarrowia lipolytica and related species for citric acid production from glycerol. Enzyme Microbial Technol., 2007, 41: 292-295.
28. B r a u n e g g  G.,  G e n s e r  K.,  B o n a  R. e.a. Production of PHAs from agricultural waste material. Intern. Sci. Workshop on biodegradable plastics and polymers. Stockholm, 1998, 144: 375-383.
29. Q a t i b i  A.,  B o r i e s  A.,  G a r c i a  J. Sulfate reduction and anaerobic glycerol degradation by a mixed microbial culture. Cur. Microbiol., 1991, 22(1): 47-52.
30. J a n a  M.,  Q u a t i b i  A.,  B e n n i s s e  R. Role of sulfate-reducing bacteria in anaerobic degradation of industrial waste water from bioethanol production plants. L'Eau, l'Industrie, les Nuisances, 2001, 243: 56-60. 
31. T a b a n d e h  F.,  V a s h e g h a n i - F a r a h a n i  E. Biosynthesis of poly-b-hydroxybutyrate as a biodegradable polymer. Iranian Polymer J., 2003, 12(1): 37-42.

PROBLEMS AND DEVELOPMENT OF BIOTECHNOLOGY UTILIZATION OF WASTES AFTER BIODIESEL PRODUCTION FROM PLANT RAW MATERIAL

E.N. Dirina, A.Yu. Vinarov, V.A. Bykov

S u m m a r y