ПОЛИМОРФИЗМ В ГЕНАХ-КАНДИДАТАХ, СВЯЗАННЫХ С РЕПРОДУКТИВНЫМИ ФУНКЦИЯМИ У ОВЕЦ (Ovis spp.)

Репродуктивные качества значительно влияют на себестоимость овцеводческой продукции. Главные гены-кандидаты репродуктивных качеств овец — BMP15, GDF9 и BMPR1B, мутации в которых повышают число яйцеклеток при овуляции и число ягнят на ягнение. Периодически сообщается о сегрегации новых мутаций в расширяющемся породном спектре. Поэтому поиск новых SNPs в ранее не исследованных породах актуален для углубления знаний о генетических механизмах, лежащих в основе плодовитости овец. В нашей работе впервые проведенсравнительный анализполных нуклеотидных последовательностей генов GDF9, BMP15 и BMP15B у овец романовской породы, других пород домашних овец (Ovis aries L.) и диких родственных видов. Идентифицированы SNPs, наиболее сильно различающиеся при сопоставлении романовской породы с автохтонными породами домашних овец России и Персидского Нагорья, а также диких видов рода Ovis. Впервые изучен полиморфизм в главных генах-кандидатах пролиферативных признаков у архара (O. ammon L.) и муфлона (O. orientalis L.). Выявлены SNPs, фиксированные у архара и домашней овцы. Исследования проводили в 2022-2023 годах в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Анализировали последовательности полных геномов домашних овец — романовской(n = 9), других российских (n = 7) и иранских (n = 6) пород, диких видов рода Ovis — азиатских муфлонов (O. orientalis, n = 16) и архаров (O. ammon, n = 4). Выравнивание на референсный геном выполнялось с помощью инструментов bwa-mem2 и SAMtools. Из полных геномов извлечены последовательности генов GDF9, BMP15 и BMP15B, в которых на основе расчета значений FST для каждого SNP для каждой пары групп проведен поиск наиболее различающихся SNPs. При сравнении последовательностей генов у романовских овец и других пород наибольшие различия были обнаружены в гене BMPR1B (FST = 0,562-0,749) в отличие от генов BMP15 (FST = 0,051-0,374) и GDF9 (FST = 0,037-0,660). Сравнение последовательностей генов у романовских овец и архара выявило наличие фиксированных SNPs (FST = 1), при этом в гене GDF9 был идентифицирован один такой SNP. Наибольшие значения FST при сравнении овец романовской породы с муфлоном составили 0,702-0,780 (ген BMPR1B), 0,113-0,645 (ген BMP15)и 0,338-0,512 (ген GDF9). Таким образом, мы идентифицировали целевые SNPs и планируем продолжить изучение их влияния на репродуктивные признаки у романовских овец в следующих работах.

Ключевые слова: SNP, гены-кандидаты, Ovis aries, Ovis ammon, Ovis orientalis, домашняя овца, дикие виды овец, плодовитость.

Плодовитость — важный экономический признак, влияющий на себестоимость овцеводческой продукции. У пород, обитающих в средних и высоких широтах, все еще проявляется сезонность размножения, при этом сезон репродуктивной активности у овец короче, чем у баранов, и обычно длится с конца лета до января (1). Для удлинения сезона размножения синхронизируют половой цикл овец, что становится важным элементом современных программ воспроизводства (2). Однако особое внимание селекционеров привлекает возможность маркер-ориентированной селекции по закреплению желательных аллелей в целевых генах-кандидатах, ассоциированных с повышением плодовитости у овец. Во многих работах сообщалось о достоверном влиянии генов BMP15, GDF9 и BMPR1B на репродуктивные признаки у овец. Эти гены называют главными генами-кандидатами репродуктивных качеств овец. Ген костного морфогенетического белка 15 (bone morphogenetic protein 15, BMP 15) BMP15 и фактора роста и дифференцировки 9 (growth differentiation factor 9, GDF9) GDF9 экспрессируются в яичниках и стимулируют рост фолликулов (3, 4), способствуют пролиферации гранулезных клеток (5, 6), влияют на сигнальные пути жизнеспособности клеток (7, 8), а также модулируют другие факторы роста и гормоны (9-11).

BMP15 — это ключевой ген-кандидат, контролирующий функцию яичников. В гене идентифицированы несколько значимых мутаций: FecXI (Fecundity Inverdale), FecXH (Fecundity Hanna) (12), FecXB (Fecundity Belclare), FecXG (Fecundity Galway) (13), FecXL (Fecundity Lacaune) (14), FecXR (Fecundity Rasa Aragonesa) (15, 16), FecXBar (Barbarine) (17). Фенотипическое проявление всех перечисленных мутаций в целом единообразно: гетерозиготный генотип приводит к повышенной плодовитости, а гомозиготный по мутантному аллелю — к стерильности. Однако гомозиготные по мутантному аллелю овцы пород французский гриветт (Grivette) (FecXGr) и польская олькуска (Olkuska) (FecXO) обладают сверхплодовитостью (hyperprolificacy) (18).

В гене рецептора 1B костного морфогенетического белка (BMPR1B) идентифицирована первая мутация (аллель FecBB, или Boorola), ассоциированная с плодовитостью. Этот генетический вариант, впервые выявленный у мериносов бурула (Booroola Merino), оказывает аддитивное влияние на число яйцеклеток при овуляции и частично доминирующее влияние на число ягнят на одно ягнение (19-21). Затем FecBB обнаружили у бенгальских овец гароле (Garole, или Bengal) из Индии (22, 23), у яванезских тощехвостых овец (Javanese) в Индонезии (24), у пород ху (Hu), хан (Small Tail Han), хуянг (Hu-yang), селе (Cele), дуоланг (Duolang) и баянбулак (Bayanbulak) из Китая (25-27), бонпала (Bonpala) из Индии (28) и калекухи (Kalehkoohi) из Ирана (29).

В гене GDF9 (FecG) выявлены три мутации — FecGH, FecGT и FecGE. Мутации FecGH (Fecundity High Fertility) (13) и FecGT (Fecundity Thoka) (30) имели фенотипический паттерн наследования, ассоциированный со стерильностью самок — гомозиготных носителей мутаций. Третью мутацию в гене GDF9 — FecGE (Fecundity Embrapa), связанную с плодовитостью, идентифицировали в бразильской линии породы Санта-Инес (Santa Inês) (31), в которой впервые был продемонстрирован новый для гена GDF9 фенотип, характеризующийся не стерильностью, а, наоборот, увеличением числа яйцеклеток при овуляции у овец, гомозиготных по FecGE, по сравнению с немутантными особями — 2,22±0,12 против 1,22±0,11 при числе ягнят на одно ягнение 1,78 против 1,13 (31). В 2014 году появилось сообщение еще об одной мутации в сайте протеазного расщепления GDF9 (FecGv, или Vacaria), обнаруженной у породы иль-де-франс (Île-de-France) (32). Кроме того, несколько однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs) в гене GDF9 влияют на число ягнят на одно ягнение у китайской локальной породы ху (Hu) (33).

Анализ научных публикаций показывает, что в мировом генофонде пород овец идентифицированы аллели, которые как в гетеро-, так и в гомозиготном состоянии связаны с повышенной плодовитостью, но также описан обратный эффект, когда аллели ассоциированы со стерильностью у гомозиготных по ним самок. Из этого следует, что изучение полиморфизма главных генов-кандидатов репродуктивных качеств (особенно у пород, на которых такие исследования ранее не проводились) становится крайне важным для практической селекции, расширяя представления о генетическом контроле репродуктивной функции у овец.

В настоящей работе мы впервые сравнили полные нуклеотидные последовательности генов GDF9, BMP15 и BMP15B у овец романовской породы, характеризующейся высокой плодовитостью, и у других пород домашних овец, а также у диких родственных видов. Идентифицированы SNPs, наиболее сильно различающиеся у романовской овцы и автохтонных пород домашних овец из России и Персидского Нагорья, а также у диких видов рода Ovis. Впервые изучен полиморфизм в главных генах-кандидатах воспроизводительных качеств у архара (O. ammon) и муфлона (O. orientalis). Выявлены SNPs, фиксированные у архара и домашней овцы.

Цель работы — изучить полиморфизм в главных генах воспроизводительных признаков (GDF9, BMP15 и BMP15B) у высокоплодовитых овец романовской породы в сравнении с малоплодными породами и их дикими сородичами.

Методика. Изученная выборка включала домашних овец (Ovis aries L.) романовской породы (n = 9), других российских пород — тушинской (n = 3) и карачаевской (n = 4) и иранских пород афшари (Afshari), гезель (Ghezel), серая ширазская (Grey Shiraz), шал (Shal), могхани (Moghani), а также каракульская порода из популяции, разводимой на территории Ирана (n = 6). Дикие виды были представлены азиатскими муфлонами (Ovis orientalis L.) (n = 16) и архарами (O. ammon L.) (n = 4).

Образцы ткани (ушной выщип) домашних овец, в том числе тушинской (n = 4), карачаевской (n = 4) и романовской (n = 9) пород, и архаров (n = 4) были предоставлены УНУ «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» в составе сетевой биоресурсной коллекции сБРК СХЖ (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста; соглашение с Минобрнауки России № 075-15-2021-1037 от 28 сентября 2021 года).

ДНК выделяли с использованием набора ДНК-Экстран-2 (ООО «Синтол», Россия). Концентрацию ДНК в растворе измеряли на флуориметре Qubit® 4.0 («Invitrogen/Life Technologies», США), OD260/280 (контроль качества) — на спектрофотометре NanоDropTM 8000 («Thermo-Fisher Sci-entific, Inc.», США). Минимальное количество ДНК при создании библиотек для секвенирования составляет 3 мкг, поэтому пороговое значение концентрации препаратов ДНК было установлено на уровне 30 нг/мкл при объеме не менее 100 мкл. Оптимальное соотношение OD260/280 составляло от 1,8 и выше. При получении препаратов с меньшей концентрацией ДНК выделяли повторно, увеличив количества исходного материала.

Полногеномное секвенирование проводили по NGS (next generation sequencing) (секвенатор NovaSeq 6000, «Illumina, Inc.», США). Библиотеки для секвенирования были подготовлены с использованием наборов TruSeq DNA Nano Library Prep kit («Illumina, Inc.», США) и Accel-NGS® 2S Plus DNA Library Kit (IDT) for Illumina® Platforms («Swift Biosciences, Inc.», США).

Последовательности полных геномов иранских пород овец были предоставлены профессором A. Esmailizadeh.

Последовательности полных геномов муфлонов (O. orientalis) были загружены из публично доступной онлайн базы данных NCBI (проект PRJNA624020, ID 624020) (34, 35). Выравнивание на референсный геном Ovis_aries_rambouillet.Oar_rambouillet_v1.0.dna.toplevel.fa.gz (https://www.ens-embl.org/Ovis_aries_rambouillet/Info/Index/,?db=core) проводили с помощью инструментов bwa-mem2 (36) и SAMtools (37). Из полных геномов были извлечены полные нуклеотидные последовательности генов-кандидатов воспроизводительных признаков овец (GDF9, BMP15 и BMP15B), в которых осуществили поиск генетических вариантов. Гены были найдены согласно их координатам в референсном геноме Ovis_aries_rambouillet.Oar_ram-bouillet_v1.0.dna.toplevel.fa.gz. Координаты включали номер хромосомы, нуклеотидную позицию начала гена, нуклеотидную позицию конца гена, указание цепи ДНК (1 — прямая, -1 — обратная). Были использованы следующие координаты: X:56594565-56601245:-1 для гена BMP15 (запись в Ensembl ENSOARG00020012408); 5:46544645-46547585:-1 для гена GDF9 (запись в Ensembl ENSOARG00020021050); 6:33990928-34214488:-1 для гена BMP15B (запись в Ensembl ENSOARG00020020206.1). Непосредственное извлечение полных последовательностей изучаемых генов проводили с использованием инструментов bwa-mem2 и SAMtools по авторским скриптам.

Для проведения анализа были сформированы следующие группы сравнения: романовская порода против других российских пород; романовская порода против иранских пород; романовская порода против муфлона; романовская порода против архара.

Наиболее различающиеся SNPs в анализируемых генах выбирали на основании расчета значений FST для каждого SNP внутри каждого гена, выполненного с использованием R пакета StAMPP (38).

Результаты. По значениям FST были выявлены SNPs, локализованные внутри генов GDF9, BMP15 и BMP15B, которые наиболее различались при сравнении нуклеотидной последовательности этих генов у романовских овец и группы, включающей породы овец, разводимые на территории России и Ирана (табл. 1). В целом наибольшие различия в последовательностях были выявлены в гене BMPR1B (FST от 0,609 до 0,749 при сравнении романовской породы с иранскими породами и FST от 0,562 до 0,701 при сравнении романовской породы с другими российскими породами), тогда как по генам BMP15 (FST соответственно от 0,051 до 0,374 и от 0,065 до 0,126) и GDF9 (FST соответственно от 0,037 до 0,580 и от 0,114 до 0,660) различия существенно меньше.

Анализ нуклеотидных последовательностей изучаемых генов у романовских овец и архара показал наличие фиксированных SNPs (FST = 1), при этом в гене GDF9 был выявлен только один такой SNP (5:46545406) (табл. 2). Наибольшие значения FST для SNP, выявленные при сравнении овец романовской породы с муфлоном, составили 0,702-0,780 (ген BMPR1B), 0,113-0,645 (ген BMP15)и 0,338-0,512 (ген GDF9).

Некоторые SNPs были идентифицированы в более чем одном сравнительном анализе. Так, SNP rs400940002 и X:56597710 в гене BMP15 различались при сравнении последовательностей этого гена у романовской породы как с иранскими породами домашних овец, так и с муфлоном.

Наибольшее число совпадений SNPs мы выявили в гене GDF9. SNPs rs160076413 и rs418388291 входили в число наиболее различающихся при сравнении романовской породы как с иранскими, так с российскими породами. SNPs rs421019907 и rs399579080 различались при сравнении романовской породы как с породами домашних овец, так и с муфлонами. SNP 5:46546592 выл выявлен при сравнении последовательностей этого гена у романовской породы с муфлоном и архаром, но различие с архаром было выше (FST = 0,767 против FST = 0,373). Интересно, что SNP rs160076408 совпадал при сравнении как с российскими породами, так и с архарами.

В гене BMPR1B все идентифицированные SNPs были уникальными для каждой из сравниваемых групп.

Далее были выявлены генотипы в позициях, которые характеризовались значениями FST, равными 1 (табл. 3). У исследованных домашних овец и у архара встречались исключительно противоположные гомозиготные генотипы. Полиморфизм в ряде анализируемых SNPs отмечался только у азиатских муфлонов. В других SNPs, в которых отсутствовал полиморфизм, генотип муфлона соответствовал генотипу домашних овец.

Репродуктивные признаки, выражающиеся в итоге в числе ягнят на одно ягнение, значительно влияют на рентабельность овцеводства. В связи с тем, что большинство овец приносят одного ягненка, идентификация генов, ответственных за те или иные признаки фертильности, представляет большой научный и экономический интерес. В качестве вероятных кандидатов, оказывающих влияние на репродуктивные признаки, рассматриваются гены SPOCK1 (возраст первого эструса), GPR173 (медиатор цикличности яичников), HB-EGF (сигнализирует об успешном начале беременности), SMARCAL1 и HMGN3a (регулируют экспрессию генов во время эмбриогенеза) (39), B4GALNT2 (развитие фолликулов, описана мутация FecLL в породе лакон — Lacaune) (40). Кроме того, некоторые гены не обсуждаются как вероятные кандидаты для применения в маркерной селекции, но они могут в той или иной степени влиять на репродуктивные признаки у овец, в частности это гены ESR1 (41), FSHR (42), FTF или NR5A2 (43).

Тем не менее именно гены BMP15, GDF9 и BMPR1B по-прежнему вызывают наибольший интерес у исследователей. Например, предпринимались попытки установить связь известных мутаций в этих генах (особенно в гене GDF9) у пород овец, разводимых в России. Были изучены частоты встречаемости аллелей гена GDF9 (полиморфизм с.260G>A) у горноалтайской (44) и дагестанской горной (45) пород, а также у манычского мериноса (46).

В романовской породе проводился генетический скрининг по основным мутациям в гене BMP15 (FecXG, FecXH, FecXI, FecXL, FecXB) и гене GDF9, в результате чего было показано отсутствие этих мутантных аллелей у всех животных в выборке (47). Продолжение скрининга на расширенной выборке также не принесло заметных успехов (48). Тем не менее следует отметить, что в целом эти результаты согласуются с нашими данными, так как ни один идентифицированный SNP не совпадал с известными ранее заменами. Вероятно, уникальные репродуктивные качества могут быть связаны с генетическими вариантами в других геномных регионах.

В работах других исследователей (44-48) изучался полиморфизм в установленных позициях, имеющих известный эффект в определенных породах, что не всегда гарантировало положительных результатов в других породах. В связи с этим мы избрали другой методический подход, основанный на анализе полных последовательностей генов BMP15, GDF9 и BMPR1B. Это позволило нам изучить полиморфизм в каждом SNP в этих генах и выявить SNPs. наиболее сильно различающиеся у высокоплодовитых и низкоплодовитых пород овец. Мы планируем продолжить исследования, чтобы установить, влияют ли эти замены на репродуктивные признаки у овец романовской породы.

Кроме того, в нашей работе были впервые изучены полные последовательности генов BMP15, GDF9 и BMPR1B у архара (O. ammon) и муфлона (O. orientalis). Следует отметить, что специфическое распределение генотипов в фиксированных SNPs у муфлона (наличие общих аллельных вариантов с архаром) могло быть вызвано событиями интрогрессии, происшедшими до или после одомашнивания. Эта гипотеза согласуется с данными анализа полных геномов диких видов, который представил доказательства адаптивной интрогрессии от архара в геномы европейского и азиатского муфлонов (49).

Итак, мы изучили полиморфизм в генах-кандидатах воспроизводительных признаков (GDF9, BMP15 и BMP15B) у высокоплодовитых романовских овец в сравнении с породами с низкой плодовитостью и с дикими видами рода Ovis (архар и муфлон). Выявлены SNPs, которые наиболее сильно различаются у романовской породы по сравнению с российскими и иранскими породами, а также с дикими видами. Впервые изучен полиморфизм в главных генах-кандидатах признаков плодовитости у архара (O. ammon) и муфлона (O. orientalis). Выявлены SNPs, фиксированные у архара и домашней овцы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мамонтова Т.В., Селионова М.И., Айбазов А.-М.М. Половая активность и спермопродукция у баранов пород шароле и иль-де-франс в разные сезоны года. Сельскохозяйственная биология, 2021, 56(4): 752-762 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.752rus).
2. Луканина В.А., Чинаров Р.Ю., Сингина Г.Н. Результативность синхронизации полового цикла у ярок (OvisariesL.) романовской породы в зависимости от схемы гормональной стимуляции и сезона года. Сельскохозяйственная биология, 2023, 58(2): 333-344 (doi: 10.15389/agrobiology.2023.2.333rus).
3. Dong J., Albertini D.F., Nishimori K., Kumar T.R., Lu N., Matzuk M.M. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature, 1996, 383(6600): 531-535 (doi: 10.1038/383531a0).
4. Nilsson E.E., Skinner M.K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biology of Reproduction, 2002, 67(3): 1018-1024 (doi: 10.1095/biolreprod.101.002527).
5. Gilchrist R.B., Ritter L.J., Myllymaa S., Kaivo-Oja N., Dragovic R.A., Hickey T.E., Ritvos O., Mottershead D.G. Molecular basis of oocyte-paracrine signalling that promotes granulosa cell proliferation. Journal of Cell Science, 2006, 119(Pt 18): 3811-3821 (doi: 10.1242/jcs.03105).
6. Spicer L.J., Aad P.Y., Allen D., Mazerbourg S., Hsueh A.J. Growth differentiation factor-9 has divergent effects on proliferation and steroidogenesis of bovine granulosa cells. Journal of Endocrinology, 2006, 189(2): 329-339 (doi: 10.1677/joe.1.06503).
7. Hussein T.S., Froiland D.A., Amato F., Thompson J.G., Gilchrist R.B. Oocytes prevent cumulus cell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of bone morphogenetic proteins. Journal of Cell Science, 2005, 118(Pt 22): 5257-5268 (doi: 10.1242/jcs.02644).
8. Orisaka M., Orisaka S., Jiang J.Y., Craig J., Wang Y., Kotsuji F., Tsang B.K. Growth differentiation factor 9 is antiapoptotic during follicular development from preantral to early antral stage. Molecular Endocrinology, 2006, 20(10): 2456-2468 (doi: 10.1210/me.2005-0357).
9. Juengel J.L., Bodensteiner K.J., Heath D.A., Hudson N.L., Moeller C.L., Smith P., Galloway S.M., Davis G.H., Sawyer H.R., McNatty K.P. Physiology of GDF9 and BMP15 signalling molecules. Animal Reproduction Science, 2004, 82-83: 447-460 (doi: 10.1016/j.anireprosci.2004.04.021).
10. Inagaki K., Shimasaki S. Impaired production of BMP-15 and GDF-9 mature proteins derived from proproteins with mutations in the proregion. Molecular and Cellular Endocrinology, 2010, 328 (1-2): 1-7 (doi: 10.1016/j.mce.2010.05.017).
11. Otsuka F., McTavish K.J., Shimasaki S. Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function. Molecular Reproduction and Development, 2011, 78(1): 9-21 (doi: 10.1002/mrd.21265).
12. Galloway S.M., McNatty K.P., Cambridge L.M., Laitinen M.P., Juengel J.L., Jokiranta T.S., McLaren R.J., Luiro K., Dodds K.G., Montgomery G.W., Beattie A.E., Davis G.H. Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15) cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner. Nature Genetics, 2000, 25(3): 279-283 (doi: 10.1038/77033).
13. Hanrahan J.P., Gregan S.M., Mulsant P., Mullen M., Davis G.H., Powell R., Galloway S.M. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries). Biology of Reproduction, 2004, 70(4): 900-909 (doi: 10.1095/biolreprod.103.023093).
14. Bodin L., Di Pasquale E., Fabre S., Bontoux M., Monget P., Persani L., Mulsant P. A novel mutation in the bone morphogenetic protein 15 gene causing defective protein secretion is associated with both increased ovulation rate and sterility in Lacaune sheep. Endocrinology, 2007, 148(1): 393-400 (doi: 10.1210/en.2006-0764).
15. Martinez-Royo A., Jurado J.J., Smulders J.P., Martí J.I., Alabart J.L., Roche A., Fantova E., Bodin L., Mulsant P., Serrano M., Folch J., Calvo J.H. A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene causes sterility and increased prolificacy in Rasa Aragonesa sheep. Animal Genetics, 2008, 39(3): 294-297 (doi: 10.1111/j.1365-2052.2008.01707.x).
16. Monteagudo L.V., Ponz R., Tejedor M.T., Lavina A., Sierra I. A 17 bp deletion in the Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) gene is associated to increased prolificacy in the Rasa Aragonesa sheep breed. Animal Reproduction Science, 2009, 110(1-2): 139-146 (doi: 10.1016/j.anireprosci.2008.01.005).
17. Lassoued N., Benkhlil Z., Woloszyn F., Rejeb A., Aouina M., Rekik M., Fabre S., Bedhiaf-Romdhani S. FecX Bar a novel BMP15 mutation responsible for prolificacy and female sterility in Tunisian Barbarine sheep. BMC Genetics, 2017, 18(1): 43 (doi: 10.1186/s12863-017-0510-x).
18. Demars J., Fabre S., Sarry J., Rossetti R., Gilbert H., Persani L., Tosser-Klopp G., Mulsant P., Nowak Z., Drobik W., Martyniuk E., Bodin L. Genome-wide association studies identify two novel BMP15 mutations responsible for an atypical hyperprolificacy phenotype in sheep. PLoS Genetics, 2013, 9(4): e1003482 (doi: 10.1371/journal.pgen.1003482).
19. Mulsant P., Lecerf F., Fabre S., Schibler L., Monget P., Lanneluc I., Pisselet C., Riquet J., Monniaux D., Callebaut I., Cribiu E., Thimonier J., Teyssier J., Bodin L., Cognié Y., Chitour N., Elsen J.M. Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(9): 5104-5109 (doi: 10.1073/pnas.091577598).
20. Souza C.J., MacDougall C., Campbell B.K., McNeilly A.S., Baird D.T. The Booroola (FecB) phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B (BMPR1B) gene. Journal of Endocrinology, 2001, 169(2): R1-6 (doi: 10.1677/joe.0.169r001).
21. Wilson T., Wu X.Y., Juengel J.L., Ross I.K., Lumsden J.M., Lord E.A., Dodds K.G., Walling G.A., McEwan J.C., O’Connell A.R., McNatty K.P., Montgomery G.W. Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor (ALK-6) that is expressed in both oocytes and granulosa cells. Biology of Reproduction, 2001, 64(4): 1225-1235 (doi: 10.1095/biolreprod64.4.1225).
22. Davis G.H., Galloway S.M., Ross I.K., Gregan S.M., Ward J., Nimbkar B.V., Ghalsasi P.M., Nimbkar C.G., Gray G.D., Subandriyo, Inounu I., Tiesnamurti B., Martyniuk E., Eythorsdottir E., Mulsant P., Lecerf F., Hanrahan J.P., Bradford G.E., Wilson T. DNA tests in prolific sheep from eight countries provide new evidence on origin of the Booroola (FecB) mutation. Biology of Reproduction, 2002, 66(6): 1869-1874 (doi: 10.1095/biolreprod66.6.1869).
23. Polley S., De S., Brahma B., Mukherjee A., Vinesh P.V., Batabyal S., Arora J.S., Pan S., Samanta A.K., Datta T.K., Goswami S.L. Polymorphism of BMPR1B, BMP15 and GDF9 fecundity genes in prolific Garole sheep. Tropical Animal Health and Production, 2010, 42(5): 985-993 (doi: 10.1007/s11250-009-9518-1).
24. Bradford G.E., Inounu I., Iniguez L.C., Tiesnamurti B., Thomas D.L. The prolificacygene of Javanese sheep. In: Major genes for reproduction in sheep /J.M. Elsen, L. Bodin, J. Thimonier (eds.). Inra, Paris, France, 1991.
25. Davis G.H. Major genes affecting ovulation rate in sheep. Genetics Selection Evolution, 2005, 37(Suppl. 1): 11-23 (doi: 10.1186/1297-9686-37-S1-S11).
26. Hua G.H., Yang L.G. A review of research progress of FecB gene in Chinese breeds of sheep. Animal Reproduction Science, 2009, 116(1-2): 1-9 (doi: 10.1016/j.anireprosci.2009.01.001).
27. Zuo B., Qian H., Wang Z., Wang X., Nisa N., Bayier A., Ying S., Hu X., Gong C., Guo Z., Wang F. A study on BMPR-IB genes of Bayanbulak sheep. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2013, 26(1): 36-42 (doi: 10.5713/ajas.2012.12238).
28. Roy J., Polley S., De S., Mukherjee A., Batabyal S., Pan S., Brahma B., Datta T.K., Goswami S.L. Polymorphism of fecundity genes (FecB, FecX, and FecG) in the Indian Bonpala sheep. Animal Biotechnology, 2011, 22(3): 151-162 (doi: 10.1080/10495398.2011.589239).
29. Mahdavi M., Nanekarani S., Hosseini S.D. Mutation in BMPR-IB gene is associated with litter size in Iranian Kalehkoohi sheep. Animal Reproduction Science, 2014, 147(3-4): 93-98 (doi: 10.1016/j.anireprosci.2014.04.003).
30. Nicol L., Bishop S.C., Pong-Wong R., Bendixen C., Holm L.E., Rhind S.M., McNeilly A.S. Homozygosity for a single base-pair mutation in the oocyte-specific GDF9 gene results in sterility in Thoka sheep. Reproduction, 2009, 138(6): 921-933 (doi: 10.1530/REP-09-0193).
31. Silva B.D., Castro E.A., Souza C.J., Paiva S.R., Sartori R., Franco M.M., Azevedo H.C., Silva T.A., Vieira A.M., Neves J.P., Melo E.O. A new polymorphism in the Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) gene is associated with increased ovulation rate and prolificacy in homozygous sheep. Animal Genetics, 2011, 42(1): 89-92 (doi: 10.1111/j.1365-2052.2010.02078.x).
32. Souza C.J., McNeilly A.S., Benavides M.V., Melo E.O., Moraes J.C. Mutation in the protease cleavage site of GDF9 increases ovulation rate and litter size in heterozygous ewes and causes infertility in homozygous ewes. Animal Genetics, 2014, 45(5): 732-739 (doi: 10.1111/age.12190).
33. Li Y., Jin W., Wang Y., Zhang J., Meng C., Wang H., Qian Y., Li Q., Cao S. Three complete linkage SNPs of GDF9 gene affect the litter size probably mediated by OCT1 in Hu sheep. DNA Cell Biology, 2020, 39(4): 563-571 (doi: 10.1089/dna.2019.4984).
34. European Nucleotide Archive (ENA). Режим доступа: https://www.ebi.ac.uk/. Без даты.
35. The National Center for Biotechnology Information (NCBI). Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Без даты.
36. Vasimuddin M., Misra S., Li H., Aluru S. Efficient architecture-aware acceleration of BWA-MEM for multicore systems. Proc.2019 IEEE International Parallel and Distributed Processing Symposium (IPDPS). Rio de Janeiro, Brazil, 2019:314-324 (doi: 10.1109/IPDPS.2019.00041).
37. Danecek P., Bonfield J.K., Liddle J., Marshall J., Ohan V., Pollard M.O., Whitwham A., Keane T., McCarthy S.A., Davies R.M., Li H. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience, 2021, 10(2): giab008 (doi: 10.1093/gigascience/giab008).
38. Pembleton L.W., Cogan N.O., Forster J.W. StAMPP: an R package for calculation of genetic differentiation and structure of mixed-ploidy level populations. Molecular Ecology Resources, 2013, 13(5): 946-952 (doi: 10.1111/1755-0998.12129).
39. Dolebo A.T., Khayatzadeh N., Melesse A., Wragg D., Rekik M., Haile A., Rischkowsky B., Rothschild M.F., Mwacharo J.M. Genome-wide scans identify known and novel regions associated with prolificacy and reproduction traits in a sub-Saharan African indigenous sheep (Ovis aries). Mammalian Genome, 2019, 30(11-12): 339-352 (doi: 10.1007/s00335-019-09820-5).
40. Drouilhet L., Mansanet C., Sarry J., Tabet K., Bardou P., Woloszyn F., Lluch J., Harichaux G., Viguié C., Monniaux D., Bodin L., Mulsant P., Fabre S. The highly prolific phenotype of Lacaune sheep is associated with an ectopic expression of the B4GALNT2 gene within the ovary. PLoS Genetics, 2013, 9(9): e1003809 (doi: 10.1371/journal.pgen.1003809).
41. Ozmen O., Seker I., Cinar Kul B., Ertugrul O. Haplotype variation of estrogen receptor a (era) gene exon 4 in Turkish sheep breeds. Genetika, 2012, 48(10): 1185-1189.
42. Chu M.X., Guo X.H., Feng C.J., Li Y., Huang D.W., Feng T., Cao G.L., Fang L., Di R., Tang Q.Q., Ma Y.H., Li K. Polymorphism of 5’ regulatory region of ovine FSHR gene and its association with litter size in Small Tail Han sheep. Molecular Biology Reports, 2012, 39(4): 3721-3725 (doi: 10.1007/s11033-011-1147-x).
43. Lu T.T., Makishima M., Repa J.J., Schoonjans K., Kerr T.A., Auwerx J., Mangelsdorf D.J. Molecular basis for feedback regulation of bile acid synthesis by nuclear receptors. Molecular Cell, 2000, 6(3): 507-515 (doi: 10.1016/s1097-2765(00)00050-2).
44. Селионова М.И., Чижова Л.Н., Суржикова Е.С., Подкорытов Н.А., Подкорытов А.Т. Полиморфизм генов CAST, GH, GDF9 овец горноалтайской породы. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2020, 50(1): 92-100 (doi: 10.26898/0370-8799-2020-1-11).
45. Оздемиров А.А., Чижова Л.Н., Хожоков А.А., Суржикова Е.С., Догеев Г.Д., Абдулмагомедов С.Ш. Полиморфизм генов CAST, GH, GDF9 овец дагестанской горной породы. Юг России: экология, развитие, 2021, 16(2): 39-44 (doi: 10.18470/1992‐1098‐2021‐2‐39‐44).
46. Скорых Л.Н., Суховеева А.В., Суржикова Е.С. Аллельные и генотипические варианты полиморфизма генов GH, GDF9 у овец породы манычский меринос. Овцы, козы, шерстяное дело, 2022, 2: 22-25 (doi: 10.26897/2074-0840-2022-2-22-25).
47. Малюченко О.П., Алексеев Я.И., Монахова Ю.А., Марзанова С.Н., Марзанов Н.С. Изучение молекулярной изменчивости генов плодовитости BMP15 и GDF9 у романовской породы овец. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2011, 6: 167-169.
48. Marzanov N.S., Devrishov D.A., Ozerov M.Y., Maluchenko O.P., Marzanova S.N., Shukurova E.B., Koreckaya E.A., Kantanen J., Petit D. The significance of a multilocus analysis for assessing the biodiversity of the Romanov sheep breed in a comparative aspect. Animals (Basel), 2023, 13(8): 1320 (doi: 10.3390/ani13081320).
49. Chen Z.H., Xu Y.X., Xie X.L., Wang D.F., Aguilar-Gómez D., Liu G.J., Li X., Esmailizadeh A., Rezaei V., Kantanen J., Ammosov I., Nosrati M., Periasamy K., Coltman D.W., Lenstra J.A., Nielsen R., Li M.H. Whole-genome sequence analysis unveils different origins of European and Asiatic mouflon and domestication-related genes in sheep. Communications Biology, 2021, 4(1): 1307 (doi: 10.1038/s42003-021-02817-4).

ORCID:
Deniskova T.E. orcid.org/0000-0002-5809-1262
Dotsev A.V. orcid.org/0000-0003-3418-2511
Shakhin A.V. orcid.org/0000-0003-4959-878X
Zinovieva N.A. orcid.org/0000-0003-4017-6863
Esmailizadeh A. orcid.org/0000-0003-0986-6639

The reproductive traits significantly affect the cost of production of sheep products. The BMP15, GDF9 and BMPR1B are the major genes for reproduction in sheep, mutations in which increase number of eggs per ovulation and litter size. The segregation of new mutations in an expanding breed diversity has been periodically reported. In this regard, the search for new SNPs in unexplored breeds is relevant to deepen knowledge about the genetic mechanisms underlying sheep prolificacy. In our work, for the first time, a comparative analysis of the complete nucleotide sequences of the GDF9, BMP15 and BMP15B genes in the Romanov sheep was carried out in comparison with other breeds of domestic sheep (Ovis aries L.) and wild relatives. The most significantly varied SNPs were identified based on comparing the Romanov breed with autochthonous breeds of domestic sheep from Russia and the Persian Highlands, as well as wild Ovis species. Polymorphism in the major genes for reproduction in sheep was studied for argali (O. ammon L.) and mouflon (O. orientalis L.) for the first time. SNPs fixed in argali and domestic sheep were identified. The studies were conducted at Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry in 2022-2023. We analyzed whole genome sequences of domestic sheep, Romanov (n = 9), other Russian breeds (n = 7), Iranian breeds (n = 6) and wild Ovis species, the Asian mouflon (O. orientalis, n = 16) and argali (O. ammon, n = 4). Alignment to the reference genome was performed using bwa-mem2 and SAMtools. The sequences of the GDF9, BMP15, and BMP15B genes were extracted from the whole genomes, in which the most different SNPs were searched based on the calculation of FST values for each SNP for each pair of groups. Gene sequences comparison of the Romanov breed with other breeds showed that the greatest differences were identified in the BMPR1B gene (FST = 0.562-0.749) when compared to the BMP15 (FST = 0.051-0.374) and GDF9 genes(FST = 0.037-0.660). Comparative analysis of gene sequences in the Romanov sheep and argali showed the presence of fixed SNPs (FST = 1), while one such SNP was identified in the GDF9 gene. The highest FST values identified based on comparing Romanov breed sheep with mouflon were 0.702-0.780 (BMPR1B gene), 0.113-0.645 (BMP15 gene) and 0.338-0.512 (GDF9 gene). Thus, target SNPs were identified the effect of which on reproductive traits in the Romanov sheep should be studied in future work.

Keywords: SNP, candidate genes, Ovis aries, Ovis ammon, Ovis orientalis, domestic sheep, wild species, prolificacy.