doi: 10.15389/agrobiology.2022.6.1178rus
УДК 636.2:591.39
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-16-00115-П).
ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ В СРЕДЕ СОЗРЕВАНИЯ НА СПОСОБНОСТЬ
ООЦИТОВ КОРОВ К ЭМБРИОНАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ in vitro
ПОСЛЕ СТАРЕНИЯ И ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО
ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
Е.Н. ШЕДОВА1, Г.Н. СИНГИНА1 ✉, S. UZBEKOVA2, R. UZBEKOV3, 4,
В.А. ЛУКАНИНА1, Е.В. ЦЫНДРИНА1
Внеклеточные везикулы (extracellular vesicles, EVs), выделенные из фолликулярной жидкости (ФЖ) яичников, вовлечены in vivo в регуляцию мейоза в женских половых клетках, в связи с чем в последние годы EVs активно изучаются как потенциальные регуляторы качества ооцитов с целью повышения эффективности технологии получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVP). В представленной работе мы впервые исследовали компетенцию к эмбриональному развитию у ооцитов коров (Bostaurus) при культивировании в присутствии EVs в процессе созревания и старении in vitro перед экстракорпоральным оплодотворением. Цель представленной работы заключалась в изучении влияния тестируемых условий на возрастные трансформации в зрелых ооцитах в процессе созревания in vitro (in vitro maturation, IVM) с точки зрения их способности после оплодотворения развиваться до стадии бластоцисты, а также качества получаемых IVP эмбрионов. EVs из ФЖ выделяли методом дифференциального ступенчатого центрифугирования и ультрацентрифугирования при 100 000 g. В полученной везикулярной фракции содержание общего белка составляло 37,5 мкг/мл ФЖ. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила наличие EVs, соответствующих по размерам экзосомам, в выделенных препаратах. Для функциональных экспериментов ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали с целью созревания в среде ТС-199, содержащей бычий сывороточный альбумин (3 мг/мл), пируват натрия (0,5 мМ) и эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл) в отсутствие (контроль) или в присутствии EVs. Везикулярный белок добавляли в среду IVM в физиологической концентрации (на 1 мл среды количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ОКК переносили в среду старения и культивировали еще в течение 12 ч, после чего подвергали экстракорпоральному оплодотворению и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, и их качество. Последнее оценивали на основании общего числа ядер в эмбрионах, которое подсчитывали с помощью цитологического анализа. Всего было проведено четыре независимых эксперимента. Число ОКК в каждой экспериментальной группе варьировало от 116 до 121. Доля раздробившихся после оплодотворения ооцитов в контроле была ниже, чем в опыте (53,5±2,9 против 63,8±2,9 %, p < 0,05). Также обнаружено положительное влияние EVs на развитие созревших и стареющих in vitro ооцитов до стадии бластоцисты после оплодотворения. В контроле выход бластоцист составлял 17,3±1,6 %. Присутствие в среде созревания EVs повышало этот показатель до 26,5±0,7 % (p < 0,05), при этом качество полученных эмбрионов не ухудшалось. Полученные данные позволяют сделать вывод, что использование EVs из ФЖ яичников коров в процедуре IVM повышает устойчивость яйцеклеток к возрастным трансформациям и, как следствие, их компетенцию к эмбриональному развитию после старения in vitro и оплодотворения. Также очевидно, что EVs на этапе экстракорпорального созревания могут быть использованы для повышения эффективности технологии получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: фолликулярная жидкость, внеклеточные везикулы, ооциты, in vitro созревание, старение, эмбриональное развитие, крупный рогатый скот.
E.N. Shedova1, G.N. Singina1 ✉, S. Uzbekova2, R. Uzbekov3, 4,
V.A. Lukanina1, E.V. Tsyndrina1
Extracellular vesicles (EVs) isolated from ovarian follicular fluid (FF) are involved in vivo in the regulation of meiosis in female gametes. Recent studies suggested follicular EVs as potential regulators of oocyte quality capable to increase the efficiency of embryo production technologies in vitro (in vitro embryo production, IVP). In this work for the first time, we have analyzed embryo development competence of bovine oocytes after in vitro maturation (IVM) in the presence of EVs and ageing before in vitro fertilization. The aim of the study was to determine the effects of these conditions to oocyte ageing-related transformations during IVM in terms of their ability to develop blastocysts, as well as the quality of IVP embryos. The EVs were separated from FF by serial centrifugations and final ultracentrifugation at 100,000g. The isolated EV fraction contained 37.5 mg of total protein per ml of FF. Isolated vesicular fractions were analyzed using transmission electron microscopy that confirmed their enrichment in exosome-like EVs. For functional experiments, cumulus-oocyte complexes (COCs) were in vitro maturated in TC-199 medium containing 3 mg/ml of bovine serum albumin, 0.5 mM sodium pyruvate and 100 ng/ml EGF in the absence (control) or presence of EVs. Vesicles were added to IVM culture at the physiological concentration (EVs isolated from 1 ml of FF were added to 1 ml of IVM medium). After 24 hours of maturation, COCs were transferred to an ageing medium, cultured for further 12 hours, then in vitro fertilized and cultured for embryo development. At day 3 after in vitro fertilization, morphological evaluation of cleaved oocytes was carried out, and at day 7, the number of embryos developed to blastocyst stage and their quality were evaluated. The number of nuclei per embryo, calculated using the cytological method, served as an assessment of the quality of the embryo. In four independent experiments performed, the number of COCs in each group varied from 116 to 121. The cleavage rate of control oocytes was lower than that in the experimental EVs group (53.5 2.9 vs. 63.8 2.9 %, respectively, p < 0.05). In addition, EVs had a positive effect on embryo development up to the blastocyst stage after IVM and aging of the oocytes. In control, blastocyst rate was 17.3±1.6 %, and the presence of EVs during IVM increased this rate to 20.2±2.5 % (p < 0.05), whereas quality of produced embryos did not change. According to the reported data, EVs from follicular fluid added during IVM may increase the resistance of bovine oocytes to age transformations and, consequently, improve oocyte competence to embryo development after aging in vitro. Therefore, EVs can improve extracorporeal oocyte maturation and the efficiency of in vitro embryo production techniques in cattle.
Keywords: extracellular vesicles, bovine follicular fluid, bovine oocytes, in vitro maturation, oocyte aging, embryo development.
1ФГБНУ Федеральный исследовательский центр |
Поступила в редакцию |
