doi: 10.15389/agrobiology.2022.6.1117rus
УДК 636.92:636.085.22:579:577.21
СОСТАВ И ФУНКЦИИ МИКРОБИОМА СЛЕПЫХ ОТРОСТКОВ КИШЕЧНИКА Oryctolagus dominis ПОД ВЛИЯНИЕМ КОМПЛЕКСНОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ
И.А. НАРКЕВИЧ1, Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ2, 3 ✉, Т.Ф. ЧЕРНЫХ1,
Л.А. ИЛЬИНА2, 3, Д.Ю. ИВКИН1, В.А. ФИЛИППОВА2, 3,
Г.Ю. ЛАПТЕВ2, Е.А. БРАЖНИК2, Е.С. ПОНОМАРЕВА2,
А.В. ДУБРОВИН2, Е.В. ФЛИСЮК1, К.А. КАЛИТКИНА2, 3,
С.П. СКЛЯРОВ3, В.Ю. МОРОЗОВ3, Н.И. НОВИКОВА2,
Д.Г. ТЮРИНА2
В современных условиях представляет интерес изучение эффективности натуральных комплексных кормовых добавок, которые позволят регулировать состав и метаболическую активность микробиома и улучшить иммунитет и физиологический статус кроликов. В настоящей работе впервые с применением биоинформатических методов обнаружено, что комплексный пробиотический биопрепарат оказывает влияние на изменение прогнозируемых метаболических путей в микробиоме кишечника кроликов. Целью работы было изучение совместного действия комплекса, содержащего минеральные вещества и пробиотик, на организм кроликов, их физиологические показатели, состав и функциональный потенциал микробиома. Исследование проводили в 2021 году на 10 кроликах породы советская шиншилла на базе вивария ФГБУ ВО СПХФУ Минздрава России. Возраст животных на начало эксперимента — 2,5 мес, живая масса — 5,37-5,53 кг. Животных разделили на две группы (по 5 гол. в каждой): I контрольная группа получала основной рацион (ОР) в соответствии с рекомендуемыми детализированными нормами РАСХН (2003 год), II опытная группа — ОР с добавлением комплексной кормовой добавки микроэлементов и пробиотического штамма бактерий в количестве 30 мг/гол. в сутки. Комплексная кормовая добавка включала микроэлементный препарат Silaccess (ООО «ТЕХНОЛОГ 2Д», Россия) в дозе 5 мг/кг живой массы. Кроме того, в добавку был включен пробиотический штамм микроорганизма Bacillussubtilis1-85. На 30-е и 60-е сут после начала эксперимента животных взвешивали натощак перед утренним кормлением, а также брали кровь для анализа. Определяли естественную резистентность (бактерицидная активность, включая лизоцимную, фагоцитарная активность нейтрофилов). Образцы химуса слепых отростков кишечника для исследования микробиома отбирали в конце эксперимента с максимально возможным соблюдением условий асептики вручную и немедленно помещали в стерильные пластиковые пробирки. Тотальную ДНК выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Бактериальное сообщество оценивали методом NGS-секвенирования на автоматическом секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с праймерами для V3-V4 региона гена 16S рРНК: 5´-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG-AGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3´ (прямой праймер), 5´-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-TATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3´ (обратный праймер). Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома проводили при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0) (https://github.com/picrust/picrust2). Математическую и статистическую обработку результатов осуществляли методом многофакторного дисперсионного анализа в программах Microsoft Excel XP/2003, R-Studio (Version 1.1.453) (https://rstudio.com). Фагоцитарный индекс был выше (p ≤ 0,05) во II опытной группе по сравнению с контрольной на 1,8, фагоцитарное число — на 32,3 % (p ≤ 0,05). С применением метода NGS-секвенирования во II группе были установлены более высокие значения индексов a-биоразнообразия Chao1, Shannon и Simpson (p ≤ 0,05) по сравнению с I группой. По данным исследований таксономического состава микроорганизмов слепых отростков кишечника кроликов выявили 12 филумов царства Bacteria, среди которых представители филума Firmicutes доминировали по численности (80,2±6,2 % в контрольной группе, 78,2±7,4 % в опытной группе). Во II группе происходило количественное увеличение филумов Verrucomicrobiota, Actinobacteriota, Patescibacteria, Proteobacteria, Desulfobacterota в 1,3-2,6 раза и снижение представленности филума Campilobacterota в 4,8 раза (p ≤ 0,05). В слепых отростках кишечника у кроликов из опытной группы наблюдалось возрастание численности бактерий рода Bacillus spp. в 2,82 раза по сравнению с контролем (p ≤ 0,05). В кишечнике животных из I контрольной группы присутствовал вид Staphylococcus sciuri (0,075±0,006 %), тогда как во II опытной группе его не обнаружили. В результате анализа, проведенного с использованием программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0), у микробного сообщества кишечника кроликов мы выявили 370 прогнозируемых метаболических путей, при этом между экспериментальными группами наблюдались различия (p ≤ 0,05) по 36 путям. В кишечном микробиоме животных из II опытной группы по сравнению с I контрольной происходила активация (p ≤ 0,05) путей, которые относились к деградации ароматических соединений и ксенобиотиков, белковому, углеводному, энергетическому обмену, биосинтезу спиртов, фотодыханию, ассимиляции формальдегида, деградации мио-, хиро- и сцилло-инозитола, синтезу клеточной стенки и спорообразованию. Доминирующее число (15 путей) усиленных потенциальных метаболических путей было связано с деградацией ароматических соединений и ксенобиотиков. Таким образом, введение в рацион кроликов породы советская шиншилла комплексной кормовой добавки на основе пробиотического штамма бактерийBacillussubtilis1-85 и микроэлементов оказывает множественное позитивное действие как на микроорганизмы (биологический контроль над патогенами, регуляция метаболических путей), так и на макроорганизм (повышение иммунитета, улучшение физиологии).
Ключевые слова: пробиотик, микроэлементы, резистентность, домашние кролики, микробиом, NGS-секвенирование, метаболические пути.
I.A. Narkevich1, E.A. Yildirim2, 3 ✉, T.F. Chernikh1, L.A. Ilyina2, 3,
D.Yu. Ivkin1, V.A. Filippova2, 3, G.Yu. Laptev2, E.A. Brazhnick2,
E.S. Ponomareva2, A.V. Dubrovin2, E.V. Flisyuk1, K.A. Kalitkina2, 3,
S.P. Sklyarov3, V.Yu. Morozov3, N.I. Novikova2, D.G. Tyurina2
There is a growing interest in the study of natural multicomponent feed additives to regulate gut microbiome composition and improve immune and physiological status of rabbits. In the present work, for the first time, it was bioinformatically found that a complex probiotic biological product affects the change in the predicted metabolic pathways of the rabbit intestinal microbiome. The aim of the work was to study the joint action of a complex containing minerals and a probiotic on physiological status, composition and functional potential of gut microbiome in rabbits. For the study (the vivarium of the FGBU VO SPKhFU of the Ministry of Health of Russia, St. Petersburg, 2021), ten Soviet chinchilla rabbits of 2.5 months of age (5.37-5.53 kg bw) were allocated to two groups of five rabbits each. Control group I received the recommended basal diet (BD, RAAS norms 2003), test group II was fed with the BD supplemented with a complex feed additive (30 mg per animal day-1) consisting of the microelement preparation Silaccess at 5 mg/kg of bodyweigh (LLC TECHNOLOG 2D, Russia) and the probiotic strain Bacillus subtilis 1-85. On days 30 and 60, the animals were weighed before morning feeding, and blood was sampled to evaluate natural resistance parameters (bactericidal function, including lysozyme activity, and phagocytic activity of neutrophils). Chyme samples of the caecum for microbiome studies aseptically collected at the end of the experiment were immediately placed in sterile plastic tubes. Total DNA was isolated using the Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The bacterial community was assessed by NGS sequencing on a MiSeq automated sequencer (Illumina, Inc., USA) using primers to the V3-V4 region of the 16S rRNA gene which allows us to identify microorganisms to the species level: the forward primer 5´-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3´ and the reverse primer, 5´-GTCTCCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTAT-CTAATCC-3´. The reconstruction and prediction of the functional content of the metagenome was performed using the PICRUSt2 (v.2.3.0) software package (https://github.com/picrust/picrust2). Mathematical and statistical processing was carried out by the multivariate analysis of variance procedure using Microsoft Excel XP/2003, R-Studio (Version 1.1.453) (https://rstudio.com). In group II compared to control, the phagocytic index was higher (p ≤ 0.05) by 1.8 %, the phagocytic number by 32.3 % (p ≤ 0.05). NGS sequencing revealed the values of the Chao1, Shannon and Simpson biodiversity indices to be higher (p ≤ 0.05) in group II compared to group I. Taxonomic analysis of caecum microbial community disclosed 12 phyla of the kingdom Bacteria among which representatives of the phylum Firmicutes dominated (80.2±6.2 % in group I, 78.2±7.4 % in group II). In group II, there was a 1.3-2.6-fold increase in the abundance of phyla Verrucomicrobiota, Actinobacteriota, Patescibacteria, Proteobacteria, Desulfobacterota and a 4.8-fold decrease in the abundance of the phylum Campylobacterota (p ≤ 0.05). In the caecum of test rabbits, the genus Bacillus spp. increased 2.82 times compared to control (p ≤ 0.05). Staphylococcus sciuri was found in group I (0.075±0.006 %) but not in group II. Data processing using the PICRUSt2 software tool (v.2.3.0) revealed 370 predictable metabolic pathways in the rabbit gut microbial community, 36 of which differed (p ≤ 0.05) between the groups. In group II, the intestinal microbiome pathways related to the degradation of aromatic compounds and xenobiotics, protein, carbohydrate, and energy metabolism, alcohol biosynthesis, photorespiration, assimilation of formaldehyde, degradation of myo-, chiro- and scillo-inositol, cell wall synthesis and spore formation activated compared to group I (p ≤ 0.05). The dominant proportion (15 pathways) of enhanced potential metabolic pathways was associated with the degradation of aromatic compounds and xenobiotics. Thus, a complex dietary additive based on the probiotic strain of Bacillus subtilis 1-85 and microelements has a multiple positive effect both on gut microorganisms (fewer pathogens, metabolic regulation) and on the macroorganism (higher values of immunity parameters, a better growth performance of Soviet chinchilla rabbits).
Keywords: probiotic, trace elements, resistance, domestic rabbits, microbiome, NGS, metabolic pathways.
1ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный |
Поступила в редакцию |
