doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1204rus
УДК 636.2.034:636.087.8:579.6:577.2
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 18-016-00207).
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
МИКРОБИОТЫ РУБЦА ЛАКТИРУЮЩИХ КОРОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОБИОТИКА ЦЕЛЛОБАКТЕРИНА+
Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ1 ✉, Г.Ю. ЛАПТЕВ1, Л.А. ИЛЬИНА1,
Т.П. ДУНЯШЕВ1, Д.Г. ТЮРИНА1, В.А. ФИЛИППОВА1,
Е.А. БРАЖНИК1, Н.В. ТАРЛАВИН1, А.В. ДУБРОВИН1,
Н.И. НОВИКОВА1, В.В. СОЛДАТОВА1, С.Ю. ЗАЙЦЕВ2
В настоящее время рационы дойных коров построены так, чтобы обеспечить максимальную скорость роста и продуктивность за короткий промежуток времени. Однако интенсивное ведение животноводства сказывается в первую очередь на здоровье животных, поскольку нарушаются свойственные жвачным пути обмена веществ. Использование подходов 16S-метагеномики позволяет оценить генетическое и метаболическое разнообразие микробиома коров и установить факторы, которые способствуют увеличению продуктивности и улучшению состояния здоровья. В настоящей работе с применением программного комплекса PICRUSt2 и MetaCyс впервые установлен факт усиления предсказанного функционального потенциала некоторых метаболических путей в микробиоме рубца коров, в рацион которых вводили штамм бактерии Enterococcus faecium 1-35 в составе пробиотика Целлобактерина+. Целью работы была оценка влияния Целлобактерина+ на зоотехнические показатели, состав микробиома рубца и функциональный потенциал микробиоты при введении препарата в рацион дойных коров. Эксперимент проводили в зимне-весенний период 2018 года на базе АО ПЗ «Пламя» (Ленинградская обл., Гатчинский р-н). По принципу аналогов были сформированы две группы (по 10 гол.) дойных коров (Bos taurus taurus) голштинизированной черно-пестрой породы 2-й и 3-й лактации со средним годовым удоем 7000-7500 кг. Пробиотик Целлобактерин+ (ООО «БИОТРОФ», г. Санкт-Петербург) вводили в рацион коров опытной группы из расчета 40 г/гол. Продолжительность опыта — 60 сут. Отбор проб рубцового содержимого (10-50 г) от трех коров из каждой группы проводили в конце эксперимента с использованием стерильного зонда. Параллельно отбирали натощак кровь для биохимического анализа из подхвостовой вены. Также определяли массовую долю жира, белка и число соматических клеток в молоке. Тотальную ДНК из исследуемых образцов выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва). Амплификацию для последующего NGS-секвенирования (Veriti Thermal Cycler, «Life Technologies, Inc.», США) с эубактериальными праймерами (IDT) 343F (5´-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3´) и 806R (5´-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3´), фланкирующими участок V1V3 гена 16S рРНК.Метагеномное секвенирование (система MiSeq, «Illumina, Inc.», США) осуществляли с набором MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.», США). Таксономическую принадлежность микроорганизмов до рода определяли в программе RDP Classifier. Рассчитывали индекс α-биоразнообразия микробиома рубца Сhao1. Анализ микробного β-разнообразия выборок методом главных компонент проводили по методике Weighted UniFrac PCoA Emperor с использованием программного пакета QIIME. Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома, семейств генов, ферментов осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0). Для анализа метаболических путей и ферментов пользовались базой данных MetaCyc (https://metacyc.org/). Скармливание пробиотика оказало достоверное влияние (р = 0,049) на повышение надоев, а также на снижение (р = 0,003) числа соматических клеток в молоке коров (на 38 тыс. · мл-1 · гол.-1). С помощью NGS-секвенирования была дана полная таксономическая и функциональная характеристика рубцовой микробиоты, включая некультивируемых представителей. Выявлены существенные различия между группами по 13 бактериальным родам. В частности, в рубце коров, получавших пробиотик Целлобактерин+ по сравнению контрольной группой снижалась доля представителей порядка Clostridia — бактерий родов Anaerofilum sp. (в 2,3 раза ниже, р ≤ 0,05) и Anaerostipes sp. (в 1,8 раза ниже, р ≤ 0,05), образующих в рубце лактат в качестве конечного продукта метаболизма глюкозы. В рубце животных, в рацион которых вводили Целлобактерин+, уменьшалась доля бактерий родов Campylobacter, Gemella, Mycoplasma, Shewanella (р ≤ 0,05) и Fusobacterium (в том числе F. necrophorum) (p ≤ 0,001), среди которых нередко встречаются патогены. Изменения в таксономической структуре микробиоты рубца под воздействием биопрепарата были связаны с метаболическими сдвигами. Предсказанный функциональный потенциал семи метаболических путей оказался усилен у коров из опытной группы по сравнению с контрольной. Так, при интродукции пробиотического штамма бактерий в 3,5 раза (р ≤ 0,05) увеличивались прогнозируемые метаболические возможности микробиома, связанные с синтезом глиоксилата из аллантоина, и в 2,3 раза (p ≤ 0,05) — связанные с биосинтезом высокоценного для жвачных пропионата из L-глутамата. Полученные данные позволяют предположить важную роль биопрепарата для поддержания гомеостаза метаболических процессов.
Ключевые слова: биопрепараты, Целлобактерин+, лактирующие коровы, рубец, 16S-метагеномика, NGS-секвенирование, метаболизм.
E.A. Yildirim1 ✉, G.Yu. Laptev1, L.A. Ilyina1, T.P. Dunyashev1,
D.G. Tyurina1, V.A. Filippova1, E.A. Brazhnik1, N.V. Tarlavin1,
A.V. Dubrovin1, N.I. Novikova1, V.V. Soldatova1, S.Yu. Zaitsev2
Today rations for dairy cows are designed to provide the highest growth rate and productivity in a short period of time. However, such intensive livestock farming affects, first of all, the health of animals, since metabolic pathways inherent in ruminants are disrupted. The use of 16S metagenomics approaches makes it possible to assess the genetic and metabolic diversity of the bovine microbiome, which allows identifying factors that can contribute to an increase in productivity and an improvement in the health of the host. In the feeding trial, dairy cows were fed with dietary probiotic Cellobacterin+ based on the Enterococcus faecium 1-35 strain (the winter-spring period of 2018, JSC PZ Plamya, Gatchinsky District, Leningrad Province). Two groups of ten Holsteinized black-and-white dairy cows (Bos taurus taurus) of the 2nd and 3rd lactation with an average annual milk yield of 7000-7500 kg were used. The basal diet was 10 kg compound feed, 2 kg yellow corn, 0.5 kg sunflower cake, 0.5 kg rapeseed cake, 1 kg hay, 25 kg grass silage, 1 kg beet molasses, and 0.2 kg MINVIT®-3 (Russia). In the morning, the test cows were fed with dietary Cellobacterin+ (OOO BIOTROF, St. Petersburg) at 40 g per cow. Cicatricial contents (10-50 g) were collected from three cows of each group at the end of the experiment. Fasting blood was taken for biochemical analysis from the tail vein with vacutainers. The blood was analyzed for total protein, total bilirubin, glucose, calcium, phosphorus, urea, reserve alkalinity, ketone bodies. The mass fraction of fat in milk was analyzed according to GOST 5867-90, protein according to GOST 23327-98, and the number of somatic cells according to GOST R 54761-2011. Total DNA from the studied samples was extracted using the Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, Inc., Lithuania) according to the attached instructions. Amplification for subsequent NGS sequencing was run (a Veriti Thermal Cycler, Life Technologies, Inc., USA) using the eubacterial primers (IDT) 343F (5´-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3´) and 806R (5´-GGACTANVGGGTWTCTAAT-3´) flanking the V1V3 region of the 16S rRNA gene. Metagenomic sequencing (a MiSeq system, Illumina, Inc., USA) was performed with a MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, Inc., USA). Chimeric sequences were excluded from analysis using the USEARCH 7.0 program (http://drive5.com/usearch/). The processing of the obtained reads using the bioinformatics platform CLC Bio GW 7.0 (Qiagen, the Netherlands) included overlapping, quality filtering (QV > 15), and primer trimming. The taxonomic affiliation of microorganisms to genus was determined using the RDP Classifier program (http://rdp.cme.msu.edu/). Mathematical and statistical processing of the results was carried out using the software packages Microsoft Office Excel 2003, R-Studio (Version 1.1.453) (https://rstudio.com). The mean values (M) and standard errors of the means (±SEM) were calculated. The results were deemed significant at p < 0.05. Analysis of microbial β-diversity of the samples by the principal component method was performed according to the Weighted UniFrac PCoA Emperor method using the QIIME software package. Reconstruction and prediction of the functional content of the metagenome, gene families, and enzymes was performed using the PICRUSt2 software package (v.2.3.0). MetaCyc database (https://metacyc.org/) was used to analyze metabolic pathways and enzymes. Feeding the probiotic had a significant effect (p = 0.049) on an increase in milk yield, as well as on a decrease (p = 0.003) in the somatic cell number in milk by 38,000/ml per cow. The NGS sequencing provided a complete taxonomic and functional characterization of the cicatricial microbiota, including uncultivated representatives. Significant differences were found between the groups for 13 bacterial genera. In particular, in the rumen of cows treated with the probiotic Cellobacterin+, compared to the control group, a lower proportion of the order Clostridia were found, namely the bacteria of the genera Anaerofilum sp. (2.3 times lower, p ≤ 0.05) and Anaerostipes sp. (1.8 times lower, p ≤ 0.05) that produce lactate in the rumen as the end product of glucose metabolism. A decrease occurred in the abundance of the genera Campylobacter, Gemella, Mycoplasma, Shewanella (p ≤ 0.05), and Fusobacterium (including F. necrophorum) (p ≤ 0.001) among which pathogens are often found. Changes in the taxonomic structure of rumen microbiota as influenced by the probiotic were also associated with metabolic changes. The predicted functional potential of seven metabolic pathways was enhanced in cows fed Cellobacterin+ compared to the control animals. Thus, when fed Cellobacterin+, there was a 3.5-fold increase (p ≤ 0.05) in the predicted level of microbiome metabolic capabilities associated with the synthesis of glyoxylate from allantoin, and 2.3-fold increase (p ≤ 0.05) in the biosynthesis of propionate from L-glutamate. These findings allow us to suggest an important role of the biological product Cellobacterin+ for maintaining the homeostasis of metabolic processes.
Keywords: biologicals, Cellobacterin+, lactating cows, rumen, 16S metagenomics, NGS sequencing, metabolism.
1ООО «БИОТРОФ+», |
Поступила в редакцию |
