БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1225rus

УДК 636.3:619:616.98:578:577.2

Работа выполнена при поддержке субсидии Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 0451-2019-0005.

 

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО НУКЛЕОКАПСИДНОГО БЕЛКА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ

А.Д. СЕРЕДА, Д.Ю. МОРОЗОВА, А.Р. ИМАТДИНОВ, В.М. ЛЫСКА,
С.П. ЖИВОДЕРОВ, И.А. СЛИВКО, А.В. ЛУНИЦИН

Чума мелких жвачных (ЧМЖ, Peste des petits ruminants) — острое лихорадочное вирусное заболевание мелких жвачных животных. В тяжелых случаях ЧМЖ, когда у животных проявляются клинические признаки, в образцах крови и тканей можно обнаружить вирусоспецифические антигены. У субклинически инфицированных животных ЧМЖ может быть диагностирована только путем серологического исследования. По простоте, высокой чувствительности и экономичности наиболее подходящим для диагностики и сероэпидемиологического надзора ЧМЖ считают тест-системы для непрямого и конкурентного иммуноферментного анализа (к-ИФА). Современные средства серодиагностики ЧМЖ разрабатывают на основе рекомбинантного нуклеокапсидного (N) белка (M. Munir с соавт., 2013). Рассматриваются различные варианты создания тест-систем для серодиагностики ЧМЖ, в частности, с использованием поликлональных сывороток к N-белку для к-ИФА или модификаций непрямого ИФА. В настоящем сообщении мы представляем результаты изучения двух модификаций созданных нами на основе рекомбинантного N-белка тест-систем для серодиагностики ЧМЖ в сравнении с коммерческим набором ID Screen® PPR Competition («IDvet», Франция). Целью этой работы было изучить характеристики компонентов экспериментальных тест-систем для диагностики ЧМЖ на основе рекомбинантного N-белка методом непрямого ИФА с пероксидазным конъюгатом протеина А и конкурентного ИФА (к-ИФА) с пероксидазным конъюгатом IgG из поликлональных кроличьих сывороток к нуклеокапсидному белку. В результате иммунизации кроликов очищенным рекомбинантным N-белком получены сыворотки с титрами 1:512-1:1024 при тестировании с помощью к-ИФА. Возможность конструирования тест-системы для диагностики ЧМЖ методом непрямого ИФА, в которой для выявления связавшихся с антигеном ЧМЖ-специфических антител использовали пероксидазный конъюгат протеина А, продемонстрирована в экспериментах с сыворотками от коз-реконвалесцентов, а также кроликов, иммунизированных N-белком. Важно, что пероксидазный конъюгат протеина А реагировал с антителами сывороток коз в составе иммунных комплексов. Показано, что антитела сыворотки крови кролика, иммунизированного очищенным рекомбинантным N-белком, реагируют с теми же антигенными детерминантами, что и антитела положительной сыворотки козы. Для конструирования тест-системы для серодиагностики ЧМЖ методом к-ИФА был изготовлен пероксидазный конъюгат на основе IgG, выделенных из специфичной к N-белку сыворотки кролика. Сыворотки свиней, иммунизированных очищенным вирусом ЧМЖ, и вакцинированных против ЧМЖ коз с титрами в реакции нейтрализации от 1:64 и выше были положительными при исследовании методом к-ИФА с применением компонентов экспериментальной тест-системы. Полученные результаты позволяют положительно оценивать перспективу разрабатываемых тест-систем для применения в диагностике ЧМЖ.

Ключевые слова: чума мелких жвачных, серодиагностика, иммуноферментный анализ, рекомбинантный нуклеокапсидный белок.

 

 

DEVELOPMENT OF TEST SYSTEMS USING A RECOMBINANT NUCLEOCAPSID VIRAL PROTEIN FOR SERODIAGNOSIS OF PESTE DES PETITS RUMINANTS

A.D. Sereda, D.Yu. Morozova, A.R. Imatdinov, V.M. Lyska,
S.P. Zhivodyorov, I.A. Slivko, A.V. Lunitsyn

Peste des petits ruminants (PPR) is an acute febrile viral disease of small ruminants. In severe cases of PPR, when animals manifest clinical signs, virus-specific antigens can be detected in blood and/or tissue samples. In subclinically infected animals, PPR can only be diagnosed using serological testing. Taking into account their simplicity, high sensitivity and cost-effectiveness, the test systems for carrying out indirect or competitive enzyme-linked immunosorbent assay (c-ELISA) are considered most suitable to be used both for the disease diagnosis and seroepidemiological surveillance. The up-to-date techniques for PPR serodiagnosis are developed on the basis of a recombinant nucleocapsid (N) protein. Various options are being worked out to create test systems for PPR serodiagnosis, in particular, using polyclonal sera against N-protein for c-ELISA or some modifications of indirect ELISA. This work was aimed at studying the characteristics of the components of some ELISA experimental test systems for PPR diagnosis using a recombinant N-protein in indirect ELISA with a protein A peroxidase conjugate or in competitive ELISA using a peroxidase IgG conjugate obtained from polyclonal rabbit sera against the nucleocapsid protein. Owing to immunization of rabbits with the purified recombinant N-protein, sera with titers of 1:512 to 1:1024 in c-ELISA were obtained. The potential of constructing a test system for PPR diagnosis through indirect ELISA, in which the peroxidase protein A conjugate was used to identify the PPR-specific antibodies bound to the antigen, has been demonstrated in experiments with sera from convalescent goats, as well as from rabbits immunized with the N-protein. It is important that the protein A peroxidase conjugate reacts with goat sera antibodies in immune complexes. The antibodies obtained from the blood serum of a rabbit immunized with the purified recombinant N-protein have been shown to react with the same epitopes as the positive goat serum antibodies. To construct c-ELISA test system for PPR serodiagnostics, a peroxidase conjugate was prepared using the IgG isolated from an N-protein specific rabbit serum. The sera from pigs immunized with the purified PPR virus and vaccinated against caprine PPR with the titers ≥ 1:64 as observed in the neutralization test (NT) were positive in c-ELISA in which the components of the experimental test system were used. The obtained results make it possible to positively evaluate the prospect of the developed test systems for PPR diagnostics.

Keywords: peste des petits ruminants, serodiagnosis, ELISA, recombinant nucleocapsid protein.

 

ФГБНУ Федеральный исследовательский центр
вирусологии и микробиологии,

601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н,
пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1,
e-mail: sereda-56@mail.ru ✉, Lady_d.morozova@mail.ru, AlmazLCF@yandex.ru, diagnoz3@yandex.ru, zhivoderov-serg@mail.ru,
ig.sko@rambler.ru,lunicyn@mail.ru

Поступила в редакцию
2 июля 2019 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML