doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1281rus
УДК 579.64:632.937.15
Работа поддержана проектом прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (ПНИЭР) по лоту шифр 2017-14-579-0030 по теме: «Создание микробиологических препаратов для расширения адаптационного потенциала сельскохозяйственных культур по питанию, устойчивости к стрессам и фитопатогенам» (шифр заявки 2017-14-579-0030-013), соглашение № 14.607.21.0178, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI60717X0178.
ИНСЕКТИЦИДНЫЕ СВОЙСТВА Bacillus thuringiensis var. israelensis.
Сообщение II. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ
И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРИСТАЛЛОГЕННЫХ
И АКРИСТАЛЛОГЕННЫХ ШТАММОВ
В.П. ЕРМОЛОВА, С.Д. ГРИШЕЧКИНА, М.Е. БЕЛОУСОВА, К.С. АНТОНЕЦ, А.А. НИЖНИКОВ
Бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis — основной агент биологической защиты от кровососущих двукрылых насекомых, многие из которых являются переносчиками трансмиссивных болезней сельскохозяйственных животных. Штаммы-продуценты для производства инсектицидных препаратов выделяют из природных объектов, получают посредством селекции ранее использованных изолятов, скрининга генетических коллекций и генной или геномной инженерии. При этом вопрос сохранности и контроля практически ценных свойств штаммов остается ключевым. Биопрепараты представляют существенный интерес в связи с их значительными преимуществами перед химическими пестицидами и рассматриваются в современных системах сельского хозяйства в качестве экологически и социально приоритетных альтернатив агрохимикатов. В представленной работе нами выполнен первый комплексный сравнительный анализ кристаллогенных и акристаллогенных вариантов Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14), выделенных после хранения штамма в разных режимах. У кристаллогенных вариантов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) впервые выявлены гены, кодирующие целевые инсектицидные токсины — Cry4 и Сry11, и показано, что акристаллогенные формы этих генов лишены. Установлено, что у кристаллогенных вариантов культуральная жидкость приблизительно в 7000 раз активнее в отношении личинок Aedes aegypti чем у акристаллогнных. Целью настоящего исследования было сопоставление морфологических, биохимических, технологических, ларвицидных свойств кристаллогенных и акристаллогенных штаммов бактерии (BtH14) и проверка наличия у них генов, кодирующих энтомоцидные токсины Сry, которые относятся к ключевым детерминантам вирулентности. Изучали штаммы 404, 87 (хранились 28 лет методом лиофилизации, затем 2 года в пробирках на скошенном рыбном агаре — РА с пересевом каждые 6 мес), штамм 7-1/23 (хранился 28 лет в кристаллах NaСl, затем 2 года в культуральной жидкости — КЖ при температуре 3 °С). Культуры рассевали методом истощающегося мазка на РА в чашках Петри. На 7-е сут роста при 30 °С отбирали кристаллогенные (404/14, 87/21, 7-1/23-4) и акристаллогенные (404/19, 87/33, 7-1/23-8) варианты методом световой микроскопии, используя краситель черный анилиновый. У вариантов не выявили различий по морфологии колоний на РА в чашках Петри: колонии были плоские, матовые, серовато-белые, шероховатые, округлые, структура мелкозернистая, консистенция вязкая. Изучение морфологии вегетативной культуры, основных биохимических свойств (образование ацетилметилкарбинола, лецитиназы, использование углеводов, расщепление крахмала и др.) и оценка титра на дрожже-полисахаридной среде также не показали различий. Продуктивность вариантов 404/14, 87/21, 7-1/23-4 и 404/19, 87/33, 7-1/23-8 была в пределах соответственно (3,36-4,02)×109 и (3,74-4,13)×109 КОЕ/мл. Ларвицидная активность кристаллогенных вариантов, которая выражалась в ЛК50 для L4 Aedes aegypti, составляла (0,12-0,16)×10−3 %, акристаллогенные варианты были неактивными в пределах следующих общепринятых разведений (×10−3 %): 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 и 0,06. Их 1 % суспензия (в 7000 раз большая концентрация) вызывали гибель 22-39 % личинок комаров через 24 ч, тогда как та же концентрация активных вариантов приводила к 100 % гибели насекомых уже через 15 мин. Обнаружено, что КЖ акристаллогенных вариантов через 12 ч образовывала осадок и надосадочный слой, а кристаллогенных — оставалась в состоянии взвеси. Исследуемые варианты BtH14 были также впервые проанализированы на наличие генов, кодирующих инсектицидные токсины. Результаты амплификации с Bti-специфичными праймерами подтвердили принадлежность кристаллогенных и акристаллогенных вариантов к BtH14. Установлено, что варианты 404/14, 87/21, 7-1/23-4 несут гены, кодирующие инсектицидные токсины Cry4 и Cry11, в то время как акристаллогенные варианты 404/19, 87/33, 7-1/23-8 лишены этих генов, что согласуется с отсутствием у них активности в отношении комаров A. aegypti.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, культуральная жидкость, ларвицидная активность, энтомоцидные токсины, Cry4, Cry11.
V.P. Ermolova, S.D. Grishechkina, M.E. Belousova, K.S. Antonets, A.A. Nizhnikov
Currently, the bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis represents a key agent for biological protection against dipteran species, which are harmful to livestock and crop production and transmit infectious diseases of economically important animals. The production strains can be obtained by isolation from natural resources, selection of previously used isolates, screening of genetic collections, and genetic or genomic engineering. The issue of preservation and control of practically valuable properties of strains is of high importance. Biologicals are of significant interest due to their substantial advantages over chemical pesticides and are considered in modern agricultural systems as environmentally and socially priority alternatives to agrochemicals. In the present work, we performed the first comprehensive comparative analysis of crystallogenic and acrystallogenic variants of Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14) isolated after storage of the strain in different modes. For crystallogenic variants, genes encoding the target insecticidal toxins, Cry4 and Cry11, were detected by the polymerase chain reaction (PCR), and it was shown that the acrystallogenic variants are devoid of these genes. It was found that the culture fluid of crystallogenic variants is approximately 7000 times more active against the Aedes aegypti larvae than the same of acrystallogenic. The aim of this work was to compare the morphological, biochemical, technological, larvicidal properties of the crystal-forming and acrystallogenic variants of the strains of Ваcillus thuringiensis var. israelensis (BtH14) and testing for the presence of genes encoding Cry insecticidal toxins, which are key determinants of virulence. We studied the strains 404 and 87 stored for 28 years by freeze-drying, then 2 years in test tubes on canted fish agar (FA) with replanting every 6 months; the 7-1/23 strain stored for 28 years in crystals of NaCl, then 2 years in culture liquid (CL) at 3 °С. Bacterial strains were inoculated on Petri dishes to obtain separate colonies. On day 7 of growth, the 404/14, 87/21, 7-1/23-4 (crystal-forming) and 404/19, 87/33, 7-1/23-8 (acrystallogenic) variants were selected by microscopic analysis using aniline black dye. The differences in the colony morphology were not revealed: the colonies were flat, opaque, grayish-white, rough, rounded, the structure was fine-grained, and the consistency was viscous. The differences either in the morphology of the vegetative cultures, or in the main biochemical properties (the formation of acetylmethyl carbinol, lecithinase, the use of carbohydrates, the splitting of starch, etc.), or in the titer on the yeast-polysaccharide medium were not shown as well. The productivity of the 404/14, 87/21, 7-1/23-4 and 404/19, 87/33, 7-1/23-8 strains varied from 3.36×109 CFU/ml to 4.02×109 CFU/ml and from 3.74×109 CFU/ml to 4.13×;109 CFU/ml, respectively. The larvicidal activity of the crystal-forming variants, expressed in LC50 for L4 Aedes aegypti, was (0.12-0.16)×10-3 %, while acrystallogenic variants were inactive within the standard dilutions (×10-3 %) 1.0; 0.5; 0.25; 0.125; 0.06. Only their 1 % suspension (7000-fold higher concentration) caused 22-39 % death of the Aedes larvae after 24 hours; the same concentration of active variants resulted in 100 % death in 15 minutes. It was established that cultural liquid of the acrystallogenic variants formed a precipitate and a supernatant layer after 12 hours, while the crystal-forming variants remained suspended. The investigated variants of BtH14 were analyzed for the presence of genes encoding insecticidal toxins. The results of the PCR analysis with the Bti-specific primers confirmed the belonging of the both crystal-forming and acrystallogenic variants to BtH14. It has been found that the 404/14, 87/21, 7-1/23-4 strains carry genes encoding the Сry4 and Cry11 insecticidal toxins, while 404/19, 87/33, 7-1/23-8 acrystallogenic variants are devoid of these genes agreeing with the absence of larvicidal activity against A. aegypti.
Keywords: Bacillus thuringiensis, culture liquid, larvicidal activity, insecticidal toxins, Cry4, Cry11.
1ФГБНУ ФНЦ животноводства — |
Поступила в редакцию |
