doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1257rus
УДК 636.2:619:579
Исследования выполнены при поддержке РНФ, проект № 15-16-00020-П.
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ
У ШТАММОВ Staphylococcus aureus, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОЛОКА КОРОВ
О.А. АРТЕМЬЕВА1, Д.А. НИКАНОВА1, Е.Н. КОЛОДИНА1,
В.В. РОМАНОВА2, Ф.А. БРОВКО1, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1
Из-за постоянного использования антимикробных препаратов в последние десятилетия резко обострилась проблема появления мультирезистентных штаммов. Инфекции, вызванные Staphylococcus aureus, наиболее распространены у высокопродуктивных животных молочного направления. Целью нашей работы было оценить фенотипическую устойчивость штаммов Staphylococcus aureus, выделенных из молока коров, к основным антибактериальным препаратам, используемым для лечения различных форм мастита на территории Российской Федерации, а также определить их минимальные ингибирующие концентрации (MIC, MIC50 и MIC90). Пробы молока отбирали в хозяйствах Центрального региона России в период с января по декабрь 2018 года от коров черно-пестрой голштинизированной породы. Всего было исследовано 314 образцов молока и выделено 447 потенциальных изолятов стафилококков. Все изоляты оценивали общепринятыми фенотипическими методами. Только 103 удовлетворяли всем критериям идентификации и использовались для последующего анализа. Тестирование чувствительности выделенных штаммов проводили диско-диффузным методом (ДДМ) к следующим антибиотикам: пенициллину (Pen, 10 ЕД), оксациллину (OX, 10 мкг), гентамицину (GN, 10 мкг), эритромицину (ER, 15 мкг), линкомицину (LN, 15 мкг), рифампицину (RF, 5 мкг), ципрофлоксацину (CP, 5 мкг), ванкомицину (VA, 30 мкг), фузидину (FZ, 10 мкг) (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Россия) на среде Mueller Hinton Agar(«HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия). Минимальные ингибирующие концентрации (MIC, MIC50, MIC90) и LD50 определяли методом 2-кратных (Log2) серийных разведений (от 64 до 0,125 мг/л) антибиотиков (пенициллин, эритромицин, гентамицин, ципрофлоксацин) в среде TSB с инокулюмом 5×105 КОЕ/мл. Инкубирование осуществляли при 37 °С в течение 20 ч на качалке (220 об/мин). Рост культур в среде TSB с антибиотиками оценивали при пересеве на среду Baird Parker Agar («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия). Результаты интерпретировали порекомендации The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Наивысшая степень устойчивости наблюдалась к эритромицину (82,5 %) и фузидину (75,7 %). Из 103 штаммов 7 были чувствительны ко всем исследуемым антибиотикам, 96 изолятов оказались устойчивы по крайней мере к одному из них. При оценке множественной устойчивости (MAR) 65 (63,1 %) штаммов оказались резистентны к четырем и более антибиотикам. Преобладающими фенотипами для выделенных изолятов были ER + LN + FZ и ER + CP (58,3 % и 47,6 % изолятов). Из 47 изолятов, устойчивых к пенициллину по ДДМ, 31 штамм продемонстрировал рост при концентрациях пенициллина ≤ 64 мг/л, при этом в диапазоне ≥ 1,0 мг/л рост наблюдался у 33,0 % штаммов. Из 85 изолятов, устойчивых к эритромицину, 15 проявляли рост при MIC ≤ 64 мг/л,в диапазон MIC ≥ 0,5 мг/л попали только 7 штаммов из 18 чувствительных по ДДМ. Из 103 исследуемых штаммов 29 (28,2 %) были устойчивы к гентамицину по ДДМ и 72 (60,2 %) проявляли рост при MIC ≥ 0,5 мг/л, а 5 штаммов — при MIC ≤ 64,0 мг/л. Из 49 устойчивых по результатам ДДМ штаммов только у двух наблюдался рост при MIC ≥ 64 мг/л. Важно отметить, что величина MIC50 не находилась в восприимчивом диапазоне ни для одного из исследуемых антибиотиков, а MIC90 показала восприимчивый диапазон для пенициллинов, аминогликозидов и фторхинолонов — соответственно > 0,5; > 0,25 и > 0,25 мг/л. Высокая фенотипической устойчивости изолятов S. aureus из молока коров в нашем исследовании подчеркивают важность рутинного скрининга изолятов S. aureus на индуцибельную фенотипическую резистентность.
Ключевые слова: мастит, Staphylococcus aureus, антибиотики, антибиотикочувствительность, MIC, фенотипическая резистентность.
PHENOTYPIC RESISTANCE TO ANTIBIOTICS OF Staphylococcus aureus STRAINS ISOLATED FROM COW MILK
O.A. Artemeva1, D.A. Nikanova1, E.N. Kolodina1, V.V. Romanova2, F.A. Brovko1, N.A. Zinovieva1
The emergence of multiresistant strains has sharply escalated in recent decades due to the wide use of antimicrobials. The infections caused by Staphylococcus aureus are most common in highly productive dairy animals. The aim of our work was to assess the phenotypic resistance of S. aureus strains isolated from cow milk to the main antibacterial drugs used to treat various forms of mastitis in the Russian Federation, as well as to determine their minimum inhibitory concentrations (MIC, MIC50 and MIC90). From January to December 2018 milk samples were taken from cows of black-motley Holstein breed at the farms of the Central region of the Russian Federation. A total of 314 milk samples were examined and 447 potential staphylococci were isolated. All isolates were evaluated by conventional phenotypic methods. Only 103 isolates met all the identification criteria and were used for further analysis. The disk diffusion method (DDM) was used to test the susceptibility of the isolated strains to the following antibiotics: penicillin (PEN, 10 U), oxacillin (OX, 10 μg), gentamicin (GN, 10 μg), erythromycin (ER, 15 μg), and lincomycin (LN, 15 mcg), rifampicin (RF, 5 mcg), ciprofloxacin (CP, 5 mcg), vancomycin (VA, 30 μg), fusidine (FZ, 10 μg) (Pharmacotherapy Research Center, Russia; Mueller Hinton Agar, HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., India). A method of double (Log2) serial dilutions of antibiotics (penicillin, erythromycin, gentamicin, and ciprofloxacin) in TSB medium (from 64 to 0.125 mg/l) with 5×105 CFU/ml inoculum was used to determine the minimum inhibitory concentrations (MIC, MIC50, MIC90) and LD50. The incubation was carried out at 37 °C for 20 hours (220 rpm). The bacterial growth in TSB medium with antibiotics was evaluated by plating on Baird Parker Agar medium (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., India). The interpretation of the results was carried out according to the recommendation of The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). The highest degree of resistance was observed to erythromycin (82.5 %) and fusidine (75.7 %). Seven of 103 strains tested were susceptible to all studied antibiotics, 96 isolates were resistant to at least one of them. When assessing multiple resistance (MAR), 65 (63.1 %) strains were resistant to four or more antibiotics. The predominant phenotypes for the isolates were ER + LN + FZ and ER + CP (58.3 % and 47.6 %, respectively). A total of 31 strains of the 47 isolates DDM-resistant to penicillin grew at ≥ 64 mg/l penicillin, while in the concentration range of ≤ 1.0 mg/l, the growth was observed in 33.0 % of the strains. Fifteen of the 85 erythromycin-resistant isolates showed growth at MIC ≥ 64 mg/l; only 7 strains out of 18 DDM-susceptible ones were in the MIC ≤ 0.5 mg/l range. A total of 29 (28.2 %) of the 103 studied strains were DDM-resistant to gentamicin, 72 (60.2 %) showed growth at MIC ≥ 0.5 mg/l, and 5 strains at MIC ≥ 64.0 mg/l. Only 2 of the 49 DDM-resistant strains grew at MIC ≥ 64 mg/l. It is important to point out that the MIC50 was not in the susceptible range for any of the studied antibiotics, and the MIC90 showed the susceptible range for penicillins, aminoglycosides, and fluoroquinolones (> 0.5, > 0.25, and > 0.25 mg/l, respectively). In our study the high phenotypic resistance indices of S. aureus isolates from cow milk emphasizes the importance of routine screening of S. aureus isolates for inducible phenotype resistance.
Keywords: mastitis, Staphylococcus aureus, antibiotics, antimicrobial susceptibility, MIC, phenotypic resistance.
1ФГБНУ ФНЦ животноводства — |
Поступила в редакцию |
