doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1110rus
УДК 636.2:577.21:577.088
При проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Исследования выполнены при поддержке РНФ, проект 19-76-20012
МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ ДНК ИЗ КОСТНЫХ ОБРАЗЦОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СОХРАНЯЕМЫХ В КРАНИОЛОГИЧЕСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ
А.С. АБДЕЛЬМАНОВА1, А.И. МИШИНА1, В.В. ВОЛКОВА1,
Р.Ю. ЧИНАРОВ1, А.А. СЕРМЯГИН1, А.В. ДОЦЕВ1, О.И. БОРОНЕЦКАЯ2, Л.В. ПЕТРИКЕЕВА2, О.В. КОСТЮНИНА1, G. BREM1, 3,
Н.А. ЗИНОВЬЕВА1
Развитие молекулярно-генетических методов дает возможность уточнить происхождение и демографическую историю пород сельскохозяйственных животных. Сохранившиеся в краниологических коллекциях образцы костей и зубов служат источником ДНК для подобных исследований. Работа с историческими образцами осложняется наличием очень малых количеств ДНК, высокой степенью ее деградации и загрязнением образцов ингибиторами ПЦР. Целью настоящей работы было сравнение результативности различных методов экстракции ДНК из исторических черепов крупного рогатого скота, пригодной для проведения молекулярно-генети-ческих исследований. Материалом служили зубы, извлеченные из исторических черепов крупного рогатого скота ярославской и холмогорской пород, хранящихся в краниологической коллекции Музея животноводства им. Е.Ф. Лискуна РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева. На первом этапе сравнивали различные методы выделения ДНК согласно протоколам к соответствующим коммерческим наборам, модифицируя используемое количества костного материала и условия лизиса: Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США), COrDIS «Экстракт» декальцин (ООО «ГОРДИЗ», Россия), М-сорб-кость (ООО «Синтол», Россия), QIAamp DNA Investigator Kit («Qiagen», США). По результатам предварительных исследований для более детального анализа отобрали QIAamp DNA Investigator Kit («Qiagen», США), в котором реализована технология выделения на колонках с силикагелевой мембраной, и Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США), основанный на использовании магнитных частиц. Количественные и качественные характеристики полученной ДНК оценивали измерением концентрации двухцепочечной ДНК на флуориметре Qubit™ («Invitrogen, Life Technologies», США) и по соотношению поглощения при λ = 260 нм и λ = 280 нм на приборе NanoDrop 8000 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Пригодность полученных препаратов ДНК для молекулярно-генетических исследований оценивали на основании мультиплексного анализа 11 микросателлитных локусов (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA122, INRA23, TGLA126, BM1818, ETH225, BM1824), а также полногеномного генотипирования на ДНК-чипах высокой плотности, содержащих более 777 тыс. SNP (single nucleotide polymorphism) (Bovine HD BeadChip, «Illumina Inc.», США). Концентрации двухцепочечной ДНК, полученной с использованием наборов QIAamp DNA Investigator Kit и Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit, варьировали соответственно от 0,146 до 2,060 нг/мкл и от 0,110 до 13,600 нг/мкл, составив в среднем 0,83±0,23 и 2,75±1,33 нг/мкл. Коэффициент корреляции (r) между концентрацией двухцепочечной ДНК в препаратах, полученных двумя разными методами, составил 0,84. Анализ микросателлитов в образцах ДНК 10 исторических черепов скота холмогорской и ярославской пород показал, что каждый из образцов несет свой уникальный генотип, отличающий его от других исторических и современных особей. Результативность SNP-генотипирования исторических образцов составила 0,533-0,878 и 0,958-0,977 для препаратов ДНК, полученных с использованием соответственно QIAamp DNA Investigator Kit и Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit. Результаты анализа микросателлитов и генотипирования SNP, с одной стороны, показывают пригодность полученной ДНК для проведения исследований полиморфизмов, с другой — подтверждают соответствие лаборатории, в которой были проведены эти исселдования, критериям аутентичности для работы с древней ДНК. Проведение широкомасштабных исследований исторических образцов с использованием различных типов ДНК маркеров позволит уточнить происхождение и демографическую историю отечественных пород крупного рогатого скота и разработать эффективные программы их сохранения.
Ключевые слова: историческая ДНК, краниологическая коллекция, выделение ДНК, микросателлитный анализ, SNP-генотипирование, крупный рогатый скот, локальные породы.
A.S. Abdelmanova1, A.I. Mishina1, V.V. Volkova 1, R.Yu. Chinarov1,
A.A. Sermyagin1, A.V. Dotsev1, O.I. Boronetskaya2, L.V. Petrikeeva2,
O.V. Kostyunina1, G. Brem1, 3, N.A. Zinovieva1
The development of molecular-genetic methods allows elucidating the origin and demographic history of breeds of farm animals. Samples of bones and teeth maintained in craniological collections can serve as a source of DNA for such studies. The work with historical samples is complicated by the presence of a very low quantity of DNA, the high degree of its degradation and by the contamination of samples by PCR inhibitors. The aim of this work was the comparison of the efficiency of various methods of DNA extraction from historical cattle skulls, suitable for molecular genetic studies. The material was teeth extracted from historical skulls of cattle of the Yaroslavl and Kholmogor breeds stored in the craniological collection of the Liskun Museum of Livestock (Timiryazev Russian State Agrarian University—Moscow Agrarian Academy). At the first stage, we compared various DNA isolation methods implemented in the form of commercial kits, i.e. Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», USA), COrDIS Extract decalcine («GORDIZ» LLC, Russia), M-sorb-bone («Syntol» LLC, Russia), QIAamp DNA Investigator Kit («Qiagen», USA), with the modification of the amount of bone material and conditions of lylis. Based on preliminary research results, we selected for more detailed studies two kits, the QIAamp DNA Investigator Kit («Qiagen», USA) which implements the technology of column with silica gel membrane, and Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», USA) which is based on using magnetic particles. The quantitative and qualitative characteristics of the obtained DNA were evaluated by measuring the concentration of double-stranded DNA using a Qubit™ fluorimeter («Invitrogen, Life Technologies», USA) and determining the ratio of the absorption at 260 nm and 280 nm (OD260/280) on a NanoDrop 8000 instrument («Thermo Fisher Scientific, Inc.», USA). The suitability of the obtained DNA extracts for molecular genetic studies was assessed based on the multiplex analysis of 11 microsatellite loci (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA122, INRA23, TGLA126, BM1818, ETH225, BM1824) as well as genome-wide genotyping on high-density DNA chips containing 777 thousand SNPs (Bovine HD BeadChip, «Illumina, Inc.», USA). Concentrations of double-stranded DNA (dsDNA) obtained using QIAamp DNA Investigator Kit and Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit ranged from 0.146 ng/µl to 2.060 ng/µl and from 0.110 ng/µl to 13,600 ng/µl, respectively, and averaged 0.83±0.23 ng/µl and 2.75±1.33 ng/µl. The correlation coefficient (r) between the concentrations of dsDNA in isolations DNA obtained by two different methods was 0.84. Analysis of microsatellites showed that each of the samples has its own unique genotype which differs from other historical and modern samples of individuals. Efficiency of SNP genotyping (Call Rate) of the historical samples was 0.533-0.878 and 0.958-0.977 for DNA preparations produced using QIAamp DNA Investigator Kit и Prep Filer™ BTA Forensic DNA Extraction Kit, respectively. The results of microsatellite analysis and SNP genotyping, on the one hand, indicate the suitability of the obtained DNA for polymorphism research, on the other hand, confirm the compliance of the laboratory in which this analysis was performed with the authenticity criteria for working with ancient DNA. Conducting large-scale studies of historical samples using different types of DNA markers will clarify the origin and demographic history of domestic cattle breeds and develop effective programs for their conservation.
Keywords: historical DNA, craniological collection, DNA extraction, microsatellite analysis, SNP genotyping, cattle, local breeds.
1ФГБНУ ФНЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, |
Поступила в редакцию |
