doi: 10.15389/agrobiology.2018.6.1202rus
УДК 636.2:591.39
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект 16-16-10069).
УСТОЙЧИВОСТЬ ООЦИТОВ КОРОВ К ВОЗРАСТНЫМ ИЗМЕНЕНИЯМ
ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛЮТЕОТРОПНЫХ ФАКТОРОВ ВО ВТОРУЮ
ФАЗУ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДО СТАДИИ МЕТАФАЗЫ II
И.Ю. ЛЕБЕДЕВА, Г.Н. СИНГИНА, Е.Н. ШЕДОВА,
А.В. ЛОПУХОВ,
О.С. МИТЯШОВА
После завершения первого деления мейоза в ооцитах у разных видов млекопитающих, включая крупный рогатый скот (КРС), резко активизируются процессы старения, которые негативно влияют на качество созревших яйцеклеток и их способность к эмбриональному развитию после оплодотворения. Как известно, эндогенный прогестерон (Р4) играет важную роль в поддержании жизнеспособности ооцитов коров, причем его продукция окружающими клетками кумулюса значительно возрастает в завершающий период созревания женских гамет от метафазы I до метафазы II (MII). Однако влияние Р4 и двух его основных стимуляторов — пролактина (ПРЛ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ) во время созревания ооцитов на их последующую резистентность к возрастным трансформациям до сих пор не изучено. Нами впервые проведено сравнение аномальных изменений хромосом на стадии MII, а также апоптотической дегенерации ооцитов, дозревших при воздействии Р4, ПРЛ и ЛГ в отсутствие и в присутствии клеток гранулезы, в процессе последующего пролонгированного культивирования яйцеклеток. Цель представленной работы заключалась в изучении влияния лютеотропных факторов (Р4, ПРЛ и ЛГ) во время второй фазы созревания in vitro ооцитов КРС до стадии МII на устойчивость последних к возрастным изменениям. Ооциты, окруженные кумулюсом, созревали в течение первых 12 ч в среде ТС-199, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 10 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и 10 мкг/мл ЛГ. Затем ооциты пересаживали в среду ТС-199, содержащую 10 % ФБС (контроль), либо в эту же среду, дополненную 50 нг/мл P4, 50 нг/мл ПРЛ или 5 мкг/мл ЛГ, и культивировали в течение последующих 12 ч в присутствии и в отсутствие клеток гранулезы. Через 24 ч созревания в двухфазной системе ооциты переносили в среду старения (ТС-199, содержащую 10 % ФБС) и дополнительно культивировали в течение 24 ч. В средах, собранных после старения ооцитов, определяли содержание Р4 методом иммуноферментного анализа. Состояние ядерного материала в ооцитах оценивали с помощью цитогенетического анализа, наличие апоптоза в ооцитах определяли методом TUNEL. Доля ооцитов, находящихся на стадии MII мейоза через 24 ч старения, была сходной во всех группах и составляла 78,2-88,4 %. В отсутствие клеток гранулезы воздействие Р4 на ооциты во вторую фазу созревания приводило к последующему уменьшению частоты деструктивных изменений MII хромосом (с 67,1±2,0 в контроле до 51,2±2,9 %, p < 0,01), тогда как внесение этих клеток в культуральную систему устраняло позитивный эффект гормона (p < 0,001). Напротив, сходное влияние ПРЛ, снижающее долю стареющих яйцеклеток с аномальной морфологией хромосом в стадии MII (с 67,7±1,6 в контроле до 46,5±5,0 %, p < 0,001), было выявлено только в присутствии гранулезных клеток. Кроме того, после дозревания в системе, не содержащей клетки гранулезы, частота апоптотической дегенерации была самой низкой в группе стареющих ооцитов, подвергшихся воздействию Р4 (17,6 против 23,5-25,2 %, p < 0,05). В присутствии гранулезных клеток антиапоптотический эффект Р4 оказался менее выражен. При этом мы не обнаружили различий между сравниваемыми группами по содержанию P4 в среде старения. Результаты исследования свидетельствуют о том, что воздействие Р4 и ПРЛ на ооциты коров во время второй фазы созревания in vitro может повышать их резистентность к последующим возрастным изменениям, связанным со снижением качества. Таким образом, эти гормоны могут быть использованы для оптимизации условий созревания ооцитов КРС в двухфазной системе.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, ооцит, двухфазная система дозревания in vitro, возрастные изменения ооцитов, прогестерон, пролактин, лютеинизирующий гормон, клетки гранулезы.
I.Yu. Lebedeva, G.N. Singina, E.N. Shedova,
A.V. Lopukhov, O.S. Mityashova
After the completion of the first division of meiosis in oocytes of various mammalian species, including cattle, the aging processes are acutely activated, which adversely affects the quality of mature ova and their competence to embryonic development after fertilization. Endogenous progesterone (P4) is known to play an important role in maintaining the viability of bovine oocytes, with its production by surrounding cumulus cells increasing significantly in the course of the final maturation period of female gametes from metaphase I to metaphase II (MII). However, effects of P4 and its two main stimulators, prolactin (PRL) and luteinizing hormone (LH), during maturation of oocytes on their resistance to age-related transformations are still poorly studied. We performed for the first time a comparative investigation of abnormal changes of MII chromosomes and apoptotic degeneration of oocytes, ripened by exposure to P4, PRL, and LH in the absence and in the presence of granulosa cells, during the subsequent prolonged culture of the ova. The aim of the present work was to study effects of luteotropic factors, P4, PRL and LH, during the second phase of in vitro maturation of bovine oocytes on the resistance of these latter to age-related changes. Oocytes surrounded by cumulus matured for the first 12 hours in the medium TCM 199 containing 10 % fetal bovine serum (FBS), 10 μg/ml follicle-stimulating hormone (FSH) and 10 μg/ml LH. Then the oocytes were transferred to a new medium, i.e. TCM 199 containing 10 % FBS (control) or the same medium supplemented with 50 ng/ml P4, 50 ng/ml PRL or 5 μg/ml LH, and cultured for the next 12 h in the presence and in the absence of granulosa cells. After 24 h of maturation in the two-phase system, the oocytes were transferred to an aging medium (TCM 199 containing 10 % FBS) and further cultured for 24 h. In media collected after oocyte aging, the P4 content was determined by enzyme immunoassay. The state of the nuclear material in oocytes was assessed using cytogenetic analysis, the presence of apoptosis in oocytes was determined by the TUNEL method. The rate of oocytes being at the MII stage of meiosis after 24 h of aging was similar in all groups and amounted 78.2-88.4 %. In the absence of granulosa cells, the effect of P4 on oocytes during the second phase of maturation led to a subsequent decrease in the frequency of destructive changes in MII chromosomes, from 67.1±2.0 (control) to 51.2±2.9 % (p < 0.01), whereas the introduction of these cells into the culture system eliminated the positive effect of the hormone (p < 0.001). On the contrary, a similar effect of PRL, reducing the rate of aging ova with the abnormal morphology of MII chromosomes, from 67.7±1.6 (control) to 46.5±5.0 % (p < 0.001), we detected only in the presence of granulosa cells. In addition, after ripening in the system not containing granulosa cells, the frequency of the apoptotic degeneration is lowest in the group of aging oocytes exposed to P4 (17.6 % vs. 23.5-25.2 %, p < 0.05). In the presence of granulosa cells, this anti-apoptotic effect of P4 is less pronounced. Meanwhile, there is no difference between the compared groups in the content of P4 in the aging medium. The results of the study suggest that effects of P4 and PRL on bovine oocytes during the second phase of maturation may increase their resistance to subsequent age-related changes associated with a decline in the quality. Thus, these hormones can be used to optimize the maturation conditions of cattle oocytes in the two-phase system.
Keywords: cattle, oocyte, two-phase system of in vitro maturation, age-related changes of oocytes, progesterone, prolactin, luteinizing hormone, granulosa cells.
ФГБНУ Федеральный научный центр |
Поступила в редакцию |
