doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus
УДК 636.2:619:578.833.3
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АТИПИЧНОГО ПЕСТИВИРУСА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
С.В. КОТЕНЕВА1, Р.А. МАКСЮТОВ2, Т.И. ГЛОТОВА1, А.Г. ГЛОТОВ1
Атипичный HoBi-подобный пестивирус крупного рогатого скота (BVDV3) — неклассифицированный кандидат в члены рода Pestivirus семейства Flaviviridae. Агент выделен впервые в 2004 году из эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, полученной в Бразилии, и проявляет высокую степень сходства с возбудителем вирусной диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС). Его присутствие в популяции крупного рогатого скота и диких жвачных животных потенциально может снижать эффективность контрольных программ ВД-БС КРС. Целью наших исследований стала разработка способа выявления атипичного пестивируса при помощи полимеразной цепной реакции в биологических продуктах и изучение его циркуляции среди домашних и диких жвачных. Были подобраны синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные позициям 9202-9218 и 9501-9521 генома референтного штамма D32/00_'HoBi' (AB871953.1), отработан режим постановки реакции и подобраны ее основные компоненты. Диагностическая чувствительность ПЦР составила 7,4x10-1 копий/мкл. Тест обладает высокой специфичностью и не выявляет РНК вируса вирусной диареи 1-го и 2-го типов, а также близкородственного вируса классической чумы свиней. При помощи разработанной ПЦР исследовали 18 образцов эмбриональных сывороток крупного рогатого скота из различных источников, 11 видов перевиваемых линий клеточных культур, используемых для культивирования вирусов в нескольких научно-исследовательских институтах России, 10 живых вакцин, 1803 пробы биологического материала, из которых 189 — внутренних органов, 1383 — сыворотки крови крупного рогатого скота, 168 — сыворотки крови северных оленей, 63 — крови маралов. Присутствие вируса установлено только в семи образцах (лотах) эмбриональной сыворотки, полученной от двух производителей и изготовленной в Южной Америке. Результаты филогенетического анализа ампликонов показали, что все семь положительных лотов группируются с BVDV-3, штамм D32/00_'HoBi' (бразильская группа). Вирус не обнаружен в перевиваемых линиях культур клеток, отечественных и импортных вакцинах. Нами не найдено доказательств циркуляции вируса среди крупного рогатого скота различных пород, в том числе иностранных, на территории Краснодарского края, Сибири и Республики Казахстан, а также у северных оленей Таймыра и Ямала, маралов Алтайского края. Однако присутствие вируса в эмбриональной сыворотке, использовавшейся при производстве вакцин, не исключает его распространения на территории России. Полученные данные подтверждают необходимость совершенствования методов диагностики пестивирусов крупного рогатого скота, а также ужесточения правил международной торговли эмбриональной сывороткой.
Ключевые слова: атипичный пестивирус, BVDV3, HoBi-подобный вирус, праймеры, полимеразная цепная реакция, культуры клеток, эмбриональные сыворотки, вакцины, филогенетический анализ, крупный рогатый скот, северные олени, маралы.
IDENTIFICATION OF THE BOVINE ATYPICAL PESTIVIRUS IN BIOLOGICAL SAMPLES
S.V. Koteneva1, R.A. Maksyutov2, T.I. Glotova1, A.G. Glotov1
Atypical cattle pestivirus (BVDV3; HoBi-like) is an unclassified candidate for the genus Pestivirus of the Flaviviridae family. The agent was isolated for the first time in 2004 from fetal bovine serum from Brazil, and shows a high degree of similarity with the BVDV1 and BVDV2. Its presence in the cattle populations can potentially reduce the effectiveness of control programs of bovine viral diarrhea. The article presents the results of developing a method for identifying of BVDV3 in the biological samples based on polymerase chain reaction. Synthetic oligonucleotide primers complementary to positions 9202-9218 and 9501-9521 of the reference strain D32/00_ 'HoBi' genome were selected. The basic parameters of the reaction have been worked out. The sensitivity of PCR was 7.4x10-1 copies/μl. It has high specificity and does not reveal RNA of the BVDV1, BVDV2 and classical swine fever virus. With the help of the developed PCR 18 samples of fetal bovine serum (FBS) from various sources, 11 types of continuous cell culture lines used for virus cultivation in several Russian research institutes, 10 attenuated live vaccines, 189 internal organs, 1383 blood sera from cattle, 168 blood sera from reindeer, and 63 blood samples from red deers were investigated. The virus was revealed only in seven lots of FBS obtained from two manufacturers and produced in South America. Phylogenetic analysis of amplicons showed all positive lots grouped with BVDV-3 strain D32/00 _'HoBi (Brazilian group). Given the potential risk of using contaminated fetal serum, further research of the spread of BVDV3 in Russia is needed. The virus was not found in continuous cell culture lines, vaccines used for human, cattle and small domestic animals. Additionally, no evidence has been found out of virus circulation among cattle of various breeds, including those imported from another countries, reindeers and red deers in the Krasnodar territory, Siberia and the Republic of Kazakhstan. The presence of the virus in the FBS used in the production of vaccines does not exclude its spread in Russia. The findings confirm the need for continuous updating and improvement of methods for diagnosing pestiviruses and tightening the rules for the international FBS trading.
Keywords: atypical pestivirus, BVDV3, HoBi-like virus, primers, polymerase chain reaction, cell cultures, fetal bovine serum, vaccines, phylogenetic analysis, cattle, reindeers, red deer.
1ФГБУН Сибирский федеральный научный центр
агробиотехнологий РАН, Институт экспериментальной
ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, |
Поступила в редакцию |
