doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1251rus
УДК 636.4:619:578:577.2.08:51-76
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00090).
ПОЛУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК I329L ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
С.А. КАТОРКИН, Е.И. КАТОРКИНА, К.А. МИМА, И.А. ТИТОВ,
А.С. МАЛОГОЛОВКИН
Вирус африканской чумы свиней (АЧС, African swine fever virus, ASFV) — крупный ДНК-содержаний вирус, единственный представитель семейства Asfarviridae. Вирус АЧС обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится препятствием для создания средств защиты от болезни. Один из способов иммунного уклонения, используемых вирусом, — мимикрия Toll-подобных рецепторов (TLR) иммуномодулирующими белками. Иммуномодулирующие белки вируса АЧС можно рассматривать как потенциально ценные инструменты для понимания патогенеза заболевания и создания средств борьбы с ним. Так, белок рI329L служит антагонистом и ингибитором сигнального пути TLR3, уменьшающим интерфероновый ответ. Белок рI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и индукцию INF-b через активацию TLR3 с его лигандом — вирусной ДНК, РНК и poly(I:C). Удаление этого белка из ASFV служит рациональным подходом к разработке ослабленной вирусвакцины. Следовательно, I329L представляет собой вирусный антагонист TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина. Целью настоящей работы было получение клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка), стабильно экспрессирующей рекомбинантный белок I329L ASFV. Нами сконструирована плазмида pBMN-I329-his, несущая полноразмерный ген I329L ASFV с полигистидиновой меткой (His-tag) на C-конце. При помощи электропорации и культивирования в среде с антибиотиком пуромицином была получена стабильная клеточная линия CHO-I329L-His, несущая рекомбинантную плазмиду pBMN-I329-his. Встраивание гена I329L в геном клеток выявляли в ПЦР с геноспецифическими праймерами с последующим нуклеотидным секвенированием, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из клеток CHO-I329L-His. С помощью иммуноблотинга подтверждено наличие белка I329L в лизате клеток. Размер рекомбинантного белка составлял 55 кДа при расчетной молекулярной массе 35 кДа. Последовательное дегликозилирование целевого белка эндогликозидазами PNGase и Endo H приводило к увеличению его электрофоретической подвижности и детектированию спейсцифических полос ~ 37 и ~ 35 кДа. Этот факт подтверждает высокую степень гликозилирования целевой молекулы, что приводит к меньшей электрофоретической подвижности. Дополнительно показано, что рекомбинантный белок I329L взаимодействовал с гипериммунными сыворотками против штамма Ставрополь 01/08 ASFV, что свидетельствовало об его аутентичности вирусному белку. Полученная стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии и может быть использована для изучения иммуномодулирующих локусов ASFV.
Ключевые слова: африканская чума свиней, ASFV, сигнальный путь TLR3, экспрессия, рекомбинантный белок pI329L, стабильная клеточная линия.
OBTAINING A STABLE CELL LINE EXPRESSING RECOMBINANT I329L PROTEIN OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS
S.A. Katorkin, E.I. Katorkina, K.A. Mima, I.A. Titov, A.S. Malogolovkin
The African swine fever virus (ASFV), a large DNA virus with icosahedral morphology, is the only representative of the family Asfarviridae. ASFV has a wide list of mechanisms for evading the host's immune system. This fact hinders the development the vaccines against ASF. One of the approaches used by the virus in immune evasion is the mimicry of Toll-like receptors (TLR) by immunomodulating proteins. ASFV immunomodulatory proteins are the most valuable tools for the understanding of the pathogenesis of the disease and to create a means of combating the disease. One such ASFV protein is pI329L, the antagonist and TLR3 signaling inhibitor, which reduces the interferon response of the body. Protein pI329L inhibits TLR3-mediated activation of NF-κB and induction of INF-b through the activation of TLR3 with its ligand — viral DNA, RNA and poly (I:C). Removing this protein from ASFV particles is a rational approach to developing a weakened virus vaccine. Therefore, I329L is characterized as a viral TLR3 antagonist, which negatively affects interferon antiviral response of the host. Purpose of the work was to obtain a CHO cell line stably expressing a TLR3 antagonist, the recombinant I329L protein of ASFV. Here, we designed the plasmid pBMN-I329-his, carrying the full-length I329L gene with 6xHis-tag at the C-terminus. By electroporation with plasmid pBMN-I329-his of the CHO cell line and further stabilization on a selective antibiotic (5 μg/ml puromycin), a stable CHO-I329L-His cell line was derived. The insertion of the I329L gene into the genome of the cell was confirmed by PCR using primers of the specific gene, followed by nucleotide sequencing, using as the template DNA isolated from the cells CHO-I329L-His. Western Blot confirmed the presence of I329L protein in the cell lysates of CHO-I329L-His. As a result of the analysis it was established that the size of the recombinant protein was 55 kDa compared to calculated 35 kDa. The sequential deglycosylation of endoglycosidases PNGase and Endo H of the target protein resulted in an increase in its electrophoretic mobility and detection of specific bands of ~ 37 and ~ 35 kDa. This fact confirms the high degree of glycosylation of the target molecule, which leads to a lower electrophoretic mobility. Additionally, the recombinant I329L protein was recognized by hyperimmune sera against the ASFV, which indicated its authenticity. The obtained stable cell line CHO-I329L-His is deposited in the cell culture museum of Federal Research Center for Virology and Microbiology and can be used to study the mechanisms of action of immunomodulating proteins, such as pI329L of the ASFV, and, therefore, to get deeper insight of the African swine fever virus biology.
Keywords: African swine fever, ASFV, TLR3 signalling, protein expression, recombinant pI329L, stable cell line.
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр
вирусологии и микробиологии, |
Поступила в редакцию |
