УДК 636.085:579.62/.63:577.21:579.083.1

doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.832rus

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-16-00114).

ИЗУЧЕНИЕ ЭПИФИТНОЙ МИКРОФЛОРЫ КАК ИСТОЧНИКА
ФОРМИРОВАНИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА СИЛОСА МЕТОДОМ
NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ1, Г.Ю. ЛАПТЕВ1, Л.А. ИЛЬИНА1, И.Н. НИКОНОВ1, В.А. ФИЛИППОВА1, В.В. СОЛДАТОВА1, Е.А. БРАЖНИК1, Н.И. НОВИКОВА1, Т.Ю. ГАГКАЕВА2

Состав и структура эпифитной и силосной микрофлоры полностью определяет направленность процессов ферментации в силосной массе, оказывая непосредственное влияние на биохимические показатели качества. Молекулярно-генетические исследования микробиоты кормовых растений и силосуемой массы ограничены небольшим числом описаний состава и функций отдельных групп микроорганизмов. Сведения о разнообразии эпифитной микрофлоры и микробиоценоза силоса, полученные методом NGS (next generation sequencing), в литературе не представлены. Нами впервые использован этот подход для изучения микробиома филлосферы и силоса и описано его достаточно богатое (вопреки традиционным представлениям) родовое разнообразие, показано наличие патогенных и некультивируемый бактерий, в том числе обнаружены типичные обитатели желудочно-кишечного тракта млекопитающих. С помощью метода NGS-секвенирования мы проанализировали структуру бактериального сообщества филлосферы и силоса ежи сборной (Dactylis glomerata L.), полученного в лабораторных условиях с применением химического консерванта AIV 2000 Plus (смесь муравьиной, пропионовой, бензойной кислот) («KEMIRA OYJ, Inc.», Финляндия). Состав, численность и разнообразие микробиоты силоса исследовали в динамике на разных этапах его созревания (3-и, 7-е, 14-е и 30-е сут). Результаты показали, что структура бактериального сообщества силосной массы D. glomerata резко отличалась от состава микроорганизмов филлосферы и менялась в значительной степени в процессе сукцессии, происходящей во время созревания силоса в присутствии смеси органических кислот. Структура эпифитной микрофлоры D. glomerata включала главным образом представителей филы Proteobacteria (94,10 %), силоса — фил Bacteroidetes (до 59,50 %) и Firmicutes (до 74,90 %). В силосе таксономическое разнообразие бактерий порядка Lactobacillales, играющих ключевую роль при силосовании, было представлено родами Lactobacillus (до 39,6 %), Enterococcus (до 36,36 %), Lactococcus (до 14,40 %), Pediococcus (до 1,45 %), семейством Leuconostocaceae (до 3,52 %). Интересен тот факт, что в силосе были обнаружены микроорганизмы филы Bacteroidetes, представители семейств Ruminococcaceae, Lachnospiraceae и Selenomonadales, которые традиционно считались типичными обитателями желудочно-кишечного тракта млекопитающих, а также некультивируемые и патогенные бактерии (15 родов бактерий семейства Enterobacteriaceae, в том числе роды Klebsiella, Salmonella, Yersinia и др., среди которых встречаются опасные возбудители заболеваний млекопитающих). На 3-и и 7-е сут силосования доминировали представители филы Bacteroidetes (соответственно 59,53 и 48,91 %), на 14-30-е сут — главным образом, представители филы Firmicutes (до 74,85 %), при этом основная доля приходилась на факультативно-анаэробные молочнокислые бактерии порядка Lactobacillales (до 74,76 %). Всего в филлосфере методом NSG-секвенирования аттрибутировано 70 родов микроорганизмов, в силосе — 84 на 3-и сут, 96 на 7-е сут, 51 на 14-е сут и 69 на 30-е сут. Использование классических методов микробиологии не позволяло ранее выявить присутствие этих бактерий в составе силосной микробиоэкосистемы.

Ключевые слова: микрофлора силоса, эпифитная микрофлора, NGS-секвенирование, органические кислоты.

 

Полный текст

 

THE INVESTIGATION OF ENDOPHYTIC MICROORGANISMS
AS A SOURCE FOR SILAGE MICROBIOCENOSIS FORMATION
USING NGS-SEQUENCING

E.A. Yildirim1, G.Yu. Laptev1, L.A Il’ina1, I.N. Nikonov1, V.A. Filippovav1, V.V. Soldatova1, E.A. Brazhnik1, N.I. Novikova1, T.Yu. Gagkaeva2

The composition of plant and silage microflora affects the fermentation processes in the silage and its final quality. To date, reports about studying fodder plants and silage microbiota by means of molecular genetic methods are few and limited to descriptions of composition and function of some groups of microorganisms. Moreover, the NGS (next generation sequencing) data on diversity of epiphytic microflora and silage microbiocoenosis are not still reported. We first used this approach in studying phyllosphere and silage microbiom, and reported it to be rather rich in composition and abundance that is in contrast with conventional understanding. At that, the pathogenic and non-culturable microbes were detected in the microbiota, including specific inhabitants of mammalian gastrointestinal tract. So using NGS we examined the structure and diversity of bacterial community of Dactylis glomerata L. harvested plants and the biomass ensilaged with chemical preservative AIV 2000 Plus («KEMIRA OYJ, Inc.», Finland) composed of mixture of formic, propionic and benzoic acids. Assays were carried out on days 3, 7, 14 and 30 of ensilaging. The results showed that the bacterial community of silage from D. glomerata sharply differed from the composition of foliage microorganisms and varied greatly in the course of successive changes which occurred during maturation of silage preserved by mixture of organic acids. The composition of plant microorganisms and silage were found to be very various in contrast with a traditional view. Among foliar microorganisms of D. glomerata there were mostly the bacteria of phylum Proteobacteria (94.1 %), and in the silage the bacteria of phylums Bacteroidetes and Firmicutes were main representatives (up to 59.5 % and 74.9 %, respectively). In taxonomic diversity of the order Lactobacillales, mainly involved in ensilaging, there were genera Lactobacillus (up to 39.6%), Enterococcus (up to 36.36 %), Lactococcus (up to 14.4 %), Pediococcus (to 1.45 %) and the family Leuconostocaceae (to 3.52 %). Interestingly, in the silage there were the bacteria of phylum Bacteroidetes, families Ruminococcaceae, Lachnospiraceae and Selenomonadales considered the common inhabitants of the mammals’ gastrointestinal tract, and also the uncultured and pathogenic microorganisms. Particularly, these were 15 genera of family Enterobacteriaceae,including genera Klebsiella, Salmonella, Yersinia, etc., among which the dangerous mammalian pathogens are frequent. On days 3 and 7, the phylum Bacteroidetes prevailed (59.53 and 48.91 %, respectively). On days 14 and 30, the phylum Firmicutes was dominant (up to 74.85 %) with the facultative aerobic bacteria of order Lactobacillales mostly found (up to 74.76 %). Using NGS, a total of 70 genera were attributed in the plant phyloshere, and in the silage there were 84 genera on day 3, 96 genera on day 7, 51 genera on day 14, and 69 genera on day 30. Classical microbiology methods are not enough to detect these bacteria among silage microbiota.

Keywords: silage microorganisms, epiphytic microflora, NGS-sequencing, organic acids.

 

1ООО «Биотроф+»,
196602 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,
ул. Малиновская, 8, лит. А, пом. 7-Н,
е-mail: deniz@biotrof.ru, laptev@biotrof.ru, ilina@biotrof.ru, nikonov@biotrof.ru, dumova@biotrof.ru, biotrof@biotrof.ru, bea@biotrof.ru;
2ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений,
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: t.gagkaeva@mail.ru

Поступила в редакцию
30 июня 2015 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало