УДК 636.4:619:616.98:578:577.2.08:51-76
doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.785rus
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта «Мол-а-вед» (15-34-20995).
ИММУНОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ ГЛИКОПРОТЕИНЫ p54 И CD2v
ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ: БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАЦИЙ И ГЕТЕРОГЕННОСТИ
К.А. МИМА, Г.С. БУРМАКИНА, И.А. ТИТОВ, А.С. МАЛОГОЛОВКИН
Вирус африканской чумы свиней (АЧС) — уникальный представитель возбудителей арбовирусных инфекций, который до сих пор остается единственным представителем семейства Asfarviridae. Он служит возбудителем одной из самых опасных болезней представителей семейства Suidae и, кроме того, способен инфицировать мягких клещей рода Ornithodoros. Генетическая и фенотипическая гетерогенность вируса АЧС остается одной из основных причин отсутствия вакцин против этого опасного трансграничного заболевания. Нами изучена структура и функции наиболее вариабельных гликопротеинов вируса АЧС p54 и CD2v с использованием биоинформатического анализа и рекомбинантных конструкций, экспрессируемых в экстрахромосомном состоянии в культурах клеток млекопитающих COS-I (клетки африканской зеленой мартышки) и HEK-293 (клетки почки эмбриона человека). Согласно результатам проведенного биоинформатического анализа, основанного на расчете индекса разнообразия аминокислотных последовательностей в пропорциях по методу Симпсона, вариабельная область (N-концевой участок) СD2v сильно гликозилирована (содержит 28-30 сайтов N- и О-гликозилирования) и находится на наружной поверхности клеточной мембраны. Эта область также содержит иммуноглобулиновый домен (1-225-я аминокислоты), что обусловливает взаимодействие СD2v с антителами. Выявленные различия в посттрансляционных модификациях и наличие генетических вариаций по белку СD2v могут объяснять разнообразие в проявлении феномена гемадсорбции у изолятов вируса АЧС. Напротив, белок p54 имеет вариабельную часть, локализованную с внутренней стороны клеточной мембраны, и гликозилированный экстраклеточный участок, расположенный с ее внешней стороны. Высокий уровень различий в нуклеотидных последовательностях гена p54 (E183L) у разных изолятов вируса АЧС может быть результатом мутационной изменчивости в ходе эволюции. Выявленными особенностями посттрансляционных модификаций и генетическими вариациями по белку СD2v, по всей видимости, объясняется разнообразие антигенных свойств изолятов вируса АЧС. Таким образом, в представленной работе впервые проанализирована посттрансляционная модификация наиболее вариабельных гликопротеинов вируса АЧС — p54 и СD2v. Посредством транзиентной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих получены рекомбинантные химерные продукты p54-EGFP и CD2v-HA, что позволило выявить различную локализацию вирусных белков в трансфицированных клетках. В частности, при исследовании культуры клеток COS-I, трансфицированных плазмидой р54-pEGFP-N1, была установлена цитоплазматическая локализация флуоресцентно меченного рекомбинантного белка p54-EGFP. В культуре клеток НЕК-293 белок CD2v обнаруживался исключительно в составе клеточной мембраны. По данным иммуноблоттинга, молекулярная масса CD2v равнялась примерно 90 кДа (при расчетной 65 кДа). Следовательно, в этом поверхностном гликопротеине вириона АЧС на углеводный компонент приходится около 30 % массы. Кроме того, результаты иммуноблоттинга указывали на наличие двух вариантов белка CD2v с молекулярной массой 25 кДа и 90 кДа, то есть предположительно его различных гликозилированных форм, что согласуется с сообщениями в специальной литературе. Итак, выполненный биоинформатический анализ и результаты исследований в культурах клеток COS-I и HEK-293 показали, что именно СD2v может считаться наиболее вероятным белком-кандидатом, определяющим взаимодействие вируса АЧС с вирусоспецифическими антителами.
Ключевые слова: африканская чума свиней, гликопротеины, вариабельность, гликозилирование, транзиентная экспрессия, иммунотипы.
K.A. Mima, G.S. Burmakina, I.A. Titov, A.S. Malogolovkin
The African swine fever virus (ASFV) is a unique representative of Asfaviridae family, which still remains the sole member of genus Asfarvirus. ASF virus is the causative agent of one of the most dangerous diseases of the animals from Suidae family, and moreover, it is capable of infecting soft ticks of the genus Ornithodoros. Genetic and phenotypic heterogeneity of ASF virus is one of the main reasons for the lack of vaccines against this dangerous transboundary disease. In this work we present the analysis of structure and functions of the most variable glycoproteins ASFV p54 and CD2v using bioinformatics analysis and recombinant constructs expressed in mammalian cell cultures, the African green monkey cell culture COS-I and the human embryonal kidney cell culture HEK-293. The index of variability of amino acid sequences for P54 and CD2v proteins was calculated by Simpson’s method. The CD2v protein has variable region (N-terminal domain), which is highly glycosylated (28-30 sites) and located in the outer surface of the cell membrane. This region also contains immunoglobulin domain (amino acids at positions 1-225), which is responsible for CD2v interaction with antibodies. The revealed differences in post-translational modifications and genetic variations of CD2v protein might explain the diversity of the hemadsorption phenomenon among ASF virus isolates. In contrast, p54 protein has variable glycosylated extracellular and intracellular parts. High level of differences in the nucleotide sequences of p54gene (E183L) for various ASFV isolates may be the result of random mutations during virus evolution. Characteristic antigenic properties of ASF virus isolates can obviously be due to found peculiar post-translational processing and genetic variations on СD2v protein. Herein we report the first bioinformatic analysis of post-traslation N- and O-glycosylation in most variable ASF virus proteins, p54 and СD2v. A transient expression of gene constructions used to obtain the recombinant products, p54-EGFP and CD2v-HA, allowed us to demonstrate the evidence for different localization of viral proteins p54-EGFP and CD2v-HA in the transfected cells. Particularly, the fluorescence caused by p54-EGFP was observed in the cytoplasm of the COS-I cells, transfected with recombinant plasmid р54-pEGFP-N1, whereas recombinant CD2v-НА protein was detected only in cell membrane. According to immunoblotting analysis, the CD2v molecular weight was 90 kDa against calculated 65 kDa indicating about 30 % of carbohydrate component in this surface glycoprotein. Moreover, 25 kDa and 90 kDa CD2v molecules, the probable differently glycosylated forms, were revealed in immonoblotting test that is in line with other published data. Thus, bioinformatic analysis and in vitro studies using transient expression in COS-I и HEK-293 cell cultures have shown that protein CD2v is the most likely candidate to define the interaction of ASF virus with the virus-specific antibodies.
Keywords: African swine fever, glycoprotein, variability, glycosylation, transient expression, immunotypes.
ФГБНУ Всероссийский НИИ ветеринарной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
